Особенности мембранных белков

В данном практикуме я буду работать с мембранными белками. Мне достаётся переносчик формиат-аниона FocA из Escherichia coli (PDB: 3KCU).

База данных OPM (Orientations of Proteins in Membranes) и примеры трансмембранных белков

Известны две основные формы трансмембранных структур, которые наблюдаются у большинства белков, - это α-спирали и β-баррели ("бочонки"). В таблице 1 приведены некоторые параметры трансмембранных структур для ряда белков с известной третичной структурой (по материалам базы данных)

Таблица 1. Описание трансмембранных белков с известной 3D структурой

PDB код	Тип (спираль, баррель)	Тип мембраны (внутренняя или внешняя, организм, органелла)	Толщина гидрофобной части мембраны (Å)	Медиана числа остатков в одном трансмембранном участке
4DKL	Спираль	Плазматическая мембрана Mus musculus (Опиоидный рецептор типа mu)	32.0 ± 1.0	24
1M0L	Спираль	Мембрана архей Halobacterium salinarum (Бактериородопсин)	31.8 ± 1.1	22
1KQF	Спираль	Внутренняя мембрана G^--бактерий из Escherichia coli (формиатдегидрогеназа)	33.7 ± 1.1	23
3QRA	Баррель	Внешняя мембрана G^--бактерий из Yersinia pestis (белок локуса прикрепления и инвазии)	25.2 ± 1.4	7,5
1UUN	Баррель	Мембрана G⁺-бактерий из Mycobacterium smegmatis (порин MspA)	40.7 ± 2.1	8
4BUM	Баррель	Внешняя мембрана митохондрий Danio rerio (канал VDAC-2)	23.4 ± 0.9	7

Обращает на себя внимание тот факт, что в β-барреле на один трансмембранный участок приходится значительно меньше остатков аминокислот, чем в α-спиральных белках, что в принципе и понятно, исходя из вторичной структуры спирали и плоского β-листа.

Создание выборки гомологов белка FocA

Был проведён blasp по последовательности белка 3KCU в базе RefSeq. Получено очень много гомологов - транспортёров формиата из различных организмов. Выборка формировалась на основе последовательностей из разных таксонов: как бактерии, так и эукариоты (по ним был проведён отдельный поиск blastp), имеющих большое (близкое к 100%) покрытие по последовательности и низкие (≤ 1e-30). Последовательности 17-ти белков, вошедших в итоговую выборку, а также исходного белка FocA, доступны по ссылке: выборка.

Анализ структуры трансмембранного канала-переносчика формиата FocA

В таблице 1 приведена информация о белке FocA, полученная из баз данных OPM и TCDB (Transporter classification database).
Таблица 2. Описание структуры переносчика формиат-аниона FocA (идентификатор PDB: 3KCU)

PDB ID	Организм	Тип мембраны	TC-код	Наклон спиралей к нормали	Количество трансмембранных спиралей
3KCU	Escherichia coli	Внутренняя мембрана G^--бактерий	1.A.16	0 ± 0º	7 (на каждый из семи мономеров)

Расшифровка TC-кода: 1 - каналы/поры, 1.A - каналы, состоящие из α-спиралей, 1.A.16 - cемейство каналов-транспортёров нитрита/формиата (FNT family).

Информация о третичной структуре белка приведена в статье:

Wang Y., Huang Y., Wang J., Cheng C., Huang W., Lu P., Shi Y. (2009). Structure of the formate transporter FocA reveals a pentameric aquaporin-like channel. Nature, 462(7272), 467–72. PubMed

Рисунок 1. Структура комплекса FocA (из статьи PMID: 19940917).
а: Показаны спирали в составе пентамерного комплекса.
b: Раскраска по заряду на поверхности белка (переплазматическая часть заряжена отрицательно - красный цвет, внутренняя - положительно - синий) → работает правило "positive inside" ☺.
c: Разрез через белок, показана пора, заряд на поверхности, образующей пору, размеры поры.

Дополнительная информация о белке FocA:

Обнаружен в археях, бактериях, водорослях, грибах и некоторых одноклеточных паразитах.
Переносит короткоцепочечные кислоты, такие как формиат, непроницаем для воды.
По структуре представляет симметричный пентамерный комплекс, в центре которого формируется пора.

Анализ множественного выравнивания трансмембранных белков

Было проведено выравнивание полученной выборки гомологов с помощью программы Muscle (использовался web-интерфейс). Результат доступен по ссылке: выборка_выров. В выравнивании у трёх белков были удалены сильно выступающие фрагменты, которые ни с чем не выравниваются и не участвуют в образовании трансмембранных структур. К выравниванию добавлена аннотация TM_REAL, в которой буквами M обозначены позиции, входящие в трансмембранные α-спирали белка FocA, для которого известна 3В-структура. Кроме того, с последовательностью FocA была проассоциирована его третичная структура.

Для гомолога белка FocA из бактерии Vibrio cholerae была получена выдача программы TMHMM (осуществляет предсказание трансмембранных α-спиралей по последовательности белка).

		
		# WP_001896847.1_Vibrio_cholerae Length: 280
		# WP_001896847.1_Vibrio_cholerae Number of predicted TMHs:  6
		# WP_001896847.1_Vibrio_cholerae Exp number of AAs in TMHs: 140.35506
		# WP_001896847.1_Vibrio_cholerae Exp number, first 60 AAs:  22.46738
		# WP_001896847.1_Vibrio_cholerae Total prob of N-in:        0.99366
		# WP_001896847.1_Vibrio_cholerae POSSIBLE N-term signal sequence
		WP_001896847.1_Vibrio_cholerae	TMHMM2.0	inside	     1    32
		WP_001896847.1_Vibrio_cholerae	TMHMM2.0	TMhelix	    33    55
		WP_001896847.1_Vibrio_cholerae	TMHMM2.0	outside	    56    74
		WP_001896847.1_Vibrio_cholerae	TMHMM2.0	TMhelix	    75    97
		WP_001896847.1_Vibrio_cholerae	TMHMM2.0	inside	    98   115
		WP_001896847.1_Vibrio_cholerae	TMHMM2.0	TMhelix	   116   138
		WP_001896847.1_Vibrio_cholerae	TMHMM2.0	outside	   139   157
		WP_001896847.1_Vibrio_cholerae	TMHMM2.0	TMhelix	   158   180
		WP_001896847.1_Vibrio_cholerae	TMHMM2.0	inside	   181   192
		WP_001896847.1_Vibrio_cholerae	TMHMM2.0	TMhelix	   193   215
		WP_001896847.1_Vibrio_cholerae	TMHMM2.0	outside	   216   253
		WP_001896847.1_Vibrio_cholerae	TMHMM2.0	TMhelix	   254   276
		WP_001896847.1_Vibrio_cholerae	TMHMM2.0	inside	   277   280

Рисунок 2. Графическая визуализация в выдаче программы TMHMM. Красным показаны предсказанные позиции расположения трансмембранных участков.

К выравниванию добавлена аннотация TM_PREDICTED, где буквами М обозначены позиции, входящие в состав трансмембранных спиралей, согласно выдаче программы TMHMM. Итоговый файл формата JAR доступен по ссылке: ВЫРАВНИВАНИЕ

Рисунок 3. Выравнивание выборки гомологов белка FocA. Раскраска по гидрофобности с уровнем консервативности 15%. Показаны аннотации TM_REAL, TM_PREDICTED, буквы М индексируют трансмембранные участки.

Рисунок 4. Третичная структура пентамерного комплекса FocA. Раскраска по гидрофобности с уровнем консервативности 15% для субъединицы А. Сверху периплазматическое пространство, цитоплазматическое внизу.

Обсуждение результатов и выводы:

На рисунке 3 видно, что позиции в трансмембранных спиральных участках консервативны, причём более сильно это проявляется в "центральных" по расположению в последовательности спиралях (2-4).
Таблица 3. Частоты встречаемости различных аминокислот в трансмембранных спиралях белка FocA

Из приведённой таблицы отчётливо видно, что в спиралях превалируют неполярные аминокислоты с гидрофобными радикалами (77%).
Участки между спиралями сравнительно менее консервативны по сравнению со спиралями, но всё же более консервативны, чем концевые участки белков, более близкие к концам последовательности межспиральные участки менее консервативны по сравнению с внутренними.
В спиралях есть полярные и даже заряженные остатки (см. таблицу 3), предположительно, эти остатки могут играть роль в спиралях, формирующих в пентамерном комплексе центральную пору, через которую проходит полярная молекула транспортируемой кислоты (формиат, нитрит).
Программа TMHMM предсказала шесть трансмембранных участков, что соответствует их числу в белке с известной третичной структурой. Во всех случаях они не совпадают идеально (но это же гомолог - такое вполне возможно), а имеют участок перекрывания.

Дополнительные задания:

1) Дыни имеют размер от 16-18 см в длину, 14 см в диаметре (примем дыню за шар диаметра 14 см), размеры эукариотической клетки - 10-50 мкм (пусть будет 30 в среднем). Толщина мембраны - 7-8 нм. Таким образом, для дыни: (8*10^-9 * 14*10^-2)/30*10^-6 м = 3.73*10^-5, т.е. 37*10^-6 м - мембрану можно сравнить со слоем на поверхности дыни толщиной в одну клетку.