Парные выравнивания белков. Применение алгоритмов парных выравниваний к белку PDXK_BACSU

1. Сравнение матриц аминокислотных замен.

На сегодняшний день существует несколько типов матриц замен аминокислотных остатков.

Самая известная и широко используемая матрица весов– BLOSUM62. Она была разработана супругами Хеникофф(Steven Henikoff & Jorja Henikoff) в 1992 году на основе базы данных BLOCKS, в которой изначально были цитоплазматические белки. В базе BLOCKS находятся множественные выравнивания последовательностей белков. В блоках выравниваний могут встречаться практически идентичные последовательности, за счет которых частоты пар могут быть ошибочно «сдвинуты». Для того, чтобы этого избежать, последовательности на заданном % идентичности кластеризуют, а порог указывают в названии матрицы. Таким образом, 62 – порог кластеризации. Если процент идентичности последовательностей выше порога, то их считают одинаковыми.

Так как мембранные белки имеют свою специфику, встречаемость частот и замен аминокислот у них сильно сдвинута, применять к ним матрицу BLOSUM62 некорректно. Поэтому для таких белков в 2000 году была разработана матрица PHAT(PHAT: A Transmembrane-Specific Substitution Matrix) (Pauline Ng, Jorja Henikoff, Steven Henikoff).

Целью работы было построение матрицы BLOSUM62, исходя из таблицы частот встречаемости всех пар аминокислот. Построенную матрицу можно найти в таблице, там же приведены все расчеты.

Было проанализовано различие между значениями весов замен фенилаланина на другие аминокислоты и на саму себя для матриц BLOSUM62, классической и реконструированной, PHAT_T75_B73. Результаты приведены в таблице 1.

		BLOSUM62	BLOSUM	PHAT_T75_B73
G	Gly	-3	-3	-2
P	Pro	-4	-3	-5
C	Cys	-2	-2	0
S	Ser	-2	-2	-2
T	Thr	-2	-2	-2
N	Asn	-3	-3	-1
Q	Gln	-3	-2	-2
D	Asp	-3	-4	-5
E	Glu	-3	-3	-5
H	His	-1	-1	-2
R	Arg	-3	-3	-7
K	Lys	-3	-3	-7
A	Ala	-2	-2	-1
M	Met	0	1	0
I	Ile	0	0	0
L	Leu	0	1	1
W	Trp	1	-1	0
F	Phe	6	6	6
Y	Tyr	3	1	4
V	Val	-1	3	-1

Замена фенилаланина на самого себя

Фенилаланин является ароматической аминокислотой и участвует в гидрофобных стэкинг-взаимодействиях, играет важную роль в стабилизации белковых структур. Во всех матрицах значения веса замены для фенилаланина на самого себя равны 6.

Замена фенилаланина на аминокислоты, близкие по свойствам

Помимо фенилаланина ароматескими являются триптофан (W) и тирозин (Y). Значения в BLOSUM62 и PHAT практически не отличаются, но в реконструированной матрице они меньше на несколько единиц. Возможно, это связано с некоторыми различиями в исходных данных.

Замена фенилаланина на аминокислоты из других функциональных групп

Рассмотрим замену фенилаланина на положительно заряженные гидрофильные кислоты аргинин и лизин. В BLOSUM62 и в реконструированной BLOSUM вес замены равен -3, а в PHAT равен -7. Это значит, что в мембранных белках замена на положительные кислоты происходит намного реже.

Вес замен фенилаланина на глутаминовую и аспарагиновую кислоты, отрицательно заряженные гидрофильные аминокислоты, практически не отличается во всех трех матрицах, однако в PHAT он всё же меньше как минимум на 1, что, видимо, связано с большей консервативностью мембранных белков по сравнению с цитоплазматическими.

2. Сравнение выравниваний, полученных для коротких мутантов вручную и построенных классическими алгоритмами Нидлмана-Вунша и Смита-Ватермана

Существуют различные алгоритмы для парного выравнивания последовательностей. Одними из самых известных являются алгоритмы Нидлмана-Вунша и Смита-Ватермана.

Алгоритм Нидлмана-Вунша осуществляет глобальное парное выравнивание, то есть выравнивание полноразмерных последовательностей. Осуществляется с помощью команды needle пакета EMBOSS.

Алгоритм Смита-Ватермана создает локальные парные выравнивания, то есть ищет максимально сходные участки последовательностей.

Оба алгоритма основаны на методе динамического программирования.

Важным критерием выравнивания является наличие гэпов. Гэп – это пропуск аминокислоты в одной из последовательностей при выравнивании. За каждый гэп назначается определенный штраф. Важные параметры, которые используют алгоритмы: штраф за открывающий гэп (Gap opening penalty; параметр -gapopened) и штраф за продолжающий гэп, то есть гэп, стоящий рядом с другим (Gap extension penalty; параметр -gapextended). Штрафы по умолчанию равны 10 и 0.5 соответственно.

Результаты сравнения выравниваний последовательности белка pdxk_bacsu с искуственно созданной последовательностью из 20 аминокислот, полученных с помощью программ needle, water, а так же вручную приведены ниже. Выравнивания сравниваются по следующим параметрам:

Длина выравнивания (length)
Процент идентичности (identity) (вычисляется по формуле I=100*M/N,где N – длина выравнивания, M – число совпавших пар аминокислот)
Процент сходства (similarity) (вычисляется по формуле I=100*M/N,где N – длина выравнивания, M – число совпавших пар аминокислот, причем совпадающими аминокислотами могут считаться кислоты со сходными свойствами бокового радикала.
Вес выравнивания по матрице BLOSUM62 (score) (сумма значений для каждой пары аминокислот в выравнивании минус штрафы за гэпы).

Мутант 1. Вероятность изменения остатка (моделирующая "ошибку" ДНК-полимеразы) – 0.6; вероятность замены остатка в случае, если данная позиция будет изменена – 0.6.

Выравнивание вручную

Length: 23;
Identity: 18/23 (78%);
Similarity: 18/23 (78%);
Score: 54.

Выровненный фрагмент приведен на рисунке 1.

Рисунок 1 - Фрагмент выравнивания последовательности мутанта 1 с исходной последовательность PDXK_BACSU

Needle

Length: 16
Identity: 16/271 ( 5.9%)
Similarity: 16/271 ( 5.9%)
Score: 58.0

Ниже представлен результат выравнивания - остатки исходной последовательности 161-182.

generations=1      1 ----------IE-KKKIHALGAQPVVIGGGL-------------------     20

                               || .|||||||||.|||.||.

PDXK_BACSU       151 MDELKTVDDMIEAAKKIHALGAQYVVITGGGKLKHEKAVDVLYDGETAEV    200

Water

Length: 16
Identity: 14/16 (87.5%)
Similarity: 14/16 (87.5%)
Score: 64.0

Ниже представлен результат выравнивания - остатки исходной последовательности 165-180.

generations=1      4 KKIHALGAQPVVIGGG     19

                     |||||||||.|||.||

PDXK_BACSU       165 KKIHALGAQYVVITGG    180

Мутант 2. Вероятность изменения остатка (моделирующая "ошибку" ДНК-полимеразы) – 0.6; вероятность замены остатка в случае, если данная позиция будет изменена – 0.8.

Выравнивание вручную.

Length: 21
Identity 16/21 (76%)
Similarity 17/21 (81%)
Score: 64.0

Выровненный фрагмент приведен на рисунке 2.

Рисунок 2 - Фрагмент выравнивания последовательности мутанта 2 с исходной последовательность PDXK_BACSU

Needle

Length: 271
Identity: 14/271 ( 5.2%)
Similarity: 15/271 ( 5.5%)
Score: 66.0

Ниже представлен результат выравнивания - остатки исходной последовательности 179-198.

generations=1         1 ----------------------------GGYGKKHEMAVDVLFDGMTA--     20

                                                    ||...|||.|||||:||.||

PDXK_BACSU          151 MDELKTVDDMIEAAKKIHALGAQYVVITGGGKLKHEKAVDVLYDGETAEV    200

Water

Length: 20
Identity: 14/20 (70.0%)
Similarity: 15/20 (75.0%)
Score: 66.0

Ниже представлен результат выравнивания - остатки исходной последовательности 179-198.

generations=1          1 GGYGKKHEMAVDVLFDGMTA     20

                         ||...|||.|||||:||.||

PDXK_BACSU           179 GGGKLKHEKAVDVLYDGETA    198

Мутант 3. Вероятность изменения остатка (моделирующая "ошибку" ДНК-полимеразы) – 0.4; вероятность замены остатка в случае, если данная позиция будет изменена – 0.8.

Выравнивание вручную

Length: 20
Identity: 17/20 (85%)
Similarity: 18/20 (90%)
Score: 70

Выровненный фрагмент приведен на рисунке 3.

Рисунок 3 - Фрагмент выравнивания последовательности мутанта 3 с исходной последовательность PDXK_BACSU

Needle

Length: 16
Identity: 16/271 ( 5.9%)
Similarity: 16/271 ( 5.9%)
Score: 58.0

Ниже представлен результат выравнивания - остатки исходной последовательности 184-201.

generations=1      1 -------------------------------EIRQEKAVDVYYFGYTAPK     19

                                                    :::.||||||.|.|.||..

PDXK_BACSU       151 MDELKTVDDMIEAAKKIHALGAQYVVITGGGKLKHEKAVDVLYDGETAEV    200

generations=1     20 L-------------------------------------------------     20

PDXK_BACSU       201 LESEMIDTPYTHGAGCTFSAAVTAELAKGAEVKEAIYAAKEFITAAIKES    250

Water

Length: 16
Identity: 14/16 (87.5%)
Similarity: 14/16 (87.5%)
Score: 64.0

Ниже представлен результат выравнивания - остатки исходной последовательности 182-201.

generations=1      1 EIRQEKAVDVYYFGYTAPKL     20

                     :::.||||||.|.|.||..|

PDXK_BACSU       182 KLKHEKAVDVLYDGETAEVL    201