Ранее в программе JalView, используя метод Neighbour Joining, мы построили 2 неукорененных филогенетических дерева. Теперь укореним одно из деревьев в среднюю точку, но для интереса сделаем это для обоих деревьев ("NJ Using % Identity" и "NJ Using BLOSUM62").
Делать это с деревьями, построенными методом UPGMA (Average Distance в программе JalView), не имеет смысла, так как в отличие от метода NJ, они уже укорененные и неметрические (с топологией, но без длин ветвей).

Итак, чтобы укоренить в среднюю точку дерево, построенное методом Neighbour Joining (NJ), воспользуемся программой retree пакета PHYLIP. О том как это сделать достаточно подробно рассказано в самом задании:

"Скопируйте файл retree.exe с диска P в свою рабочую директорию. Скопируйте файл с деревом в Newick-формате в файл с именем intree (именно так, без расширения!) Запустите retree (из командной строки Windows; например можно в Far manager навести курсор на файл retree.exe и нажать ) Постарайтесь сами разобраться, как работать с программой retree. Для этого внимательно читайте то, что появляется в окне. Нужное вам действие — укоренение в среднюю точку ("Midpoint root the tree")."

В дополнение, отметим, что, нажав "Y", для построения дерева, далее нажали на "?", чтобы посмотреть справку.
После чего, нажали на "M", чтобы укоренить построенное дерево в центральную точку (ниже приведена строчка из справки, показывающая, что нам нужно было нажать именно на "M")

→ дерево до укоренения

→ укорененное дерево

→ правильное дерево

Укоренение произошло правильно, в ветвь {CLOTE, CLOB1} против {STRPN, STRP1, BACSU, BACAN, STAES, STAA1}, несмотря на то, что изначально дерево, построенное методом "NJ Using % Identity" не совпало с правильным из-за отсутствия соединения ветвей {BACAN, BACSU} и {STAA1, STAES} друг с другом.
Деревья до и после укоренения отличаются только длиной ветви {CLOTE, CLOB1}.

2) Neighbour Joining Using BLOSUM62

→ дерево до укоренения

→ укорененное дерево

→ правильное дерево

Дерево до укоренения, построенное этим методом ("NJ Using BLOSUM62"), совпадает с деревом до укоренения, построенным предыдущим методом ("NJ Using % Identity"), независимо от того, что ветви {BACSU, BACAN} и {STRPN, STRP1} поменялись местами, это ничего не меняет.
Укоренение, как и в предыдущем случае произошло правильно, в ту же ветвь {CLOTE, CLOB1} против {STRPN, STRP1, BACSU, BACAN, STAES, STAA1}. Тут деревья до и после укоренения отличаются тоже только длиной ветви {CLOTE, CLOB1}.

2. Использование внешней группы

Деревья, построенные методом максимальной экономии ("Maximum parsimony") невозможно укоренить в среднюю точку, так как метод не реконструирует длины ветвей, поэтому самый длинный путь от листа к листу не посчитать, соответственно и среднюю точку никак не найти. Но можно воспользоваться укоренением с помощью внешней группы.

В качестве внешней группы выбираем белок того же семейства (EFG) из кишечной палочки (efg_ecoli). Для этого к файлу с невыровненными последовательностями белков фирмикут с функцией "Фактор элонгации трансляции G" добавляем последовательность белка из кишечной палочки, используя команду cat:

cat all_bacteria.fasta efg_ecoli.fasta > all_bacteria_and_ecoli.fasta

Затем выравниваем полученные последовательности с помощью программы muscle:

muscle -in all_bacteria_and_ecoli.fasta -out alignment_all_bacteria_and_ecoli.fasta

Результат выравнивания импоруем в программу MEGA, предварительно отредактировав имена последовательностей (оставив только мнемонику видов).

Теперь строим дерево (Maximum Parsimony в меню Phylogeny) и укореняем его в ветвь, ведущую к ECOLI (Subtree > Root). Используя кнопку Show Subtree Separately получаем изображение дерева без ECOLI. Полученное изображение укорененного дерева приведено ниже:

           → укорененное дерево

→ правильное дерево

В очередной раз укоренение успешно прошло в ветвь {CLOTE, CLOB1} против {STRPN, STRP1, BACSU, BACAN, STAES, STAA1}.
Но реконструирование дерева методом максимальной экономии с использованием внешней группы произошло с ошибками - ветвь {BACSU, BACAN} не выделена, а разделена на отдельные; соединены между собой ветви {STAA1, STAES} и {STRPN, STRP1} вместо соединения ветвей {BACAN, BACSU} и {STAA1, STAES}.

3. Бутстрэп

Бутстрэп-анализ филогении отобранных белков проведем, используя один из методов, доступных в программе MEGA.
Например, ниже приведены изображения деревьев, полученные в результате бутстрэп-анализа белков с использованием метода UPGMA (число реплик было установлено равным 100).

     → original tree

    → bootstrap consensus tree

→ правильное дерево

Оба полученных дерева (Original tree и Bootstrap consensus tree) совпадают. Более того, эти деревья полностью совпадают и с правильным деревом. Естественно все 5 нетривиальных ветвей у трех представленных выше деревьев тоже одинаковые.

Неправильных ветвей нет, поэтому и сравнить поддержку мы не можем. Но заметим, что у 4-х нетривиальных ветвей (все они конечно правильные) максимальная поддержка (100% бутстрэп-копий с данной ветвью).