Понятие о выравнивании. Эволюционное выравнивание.

1. Построение вручную выравнивания фрагментов последовательности двух родственных белков

- cкопировали пару коротких последовательностей в fasta-формате из таблицы в файл shortseqs.fasta.

- запустили программу GeneDoc и импортировали этот файл.

- выровняли последовательности, стараясь, чтобы было сопоставлено максимальное число одинаковых букв.

seq1

- сохранили выравнивание под именем alignment1.msf.

Рассчитываем процент идентичности двух последовательностей:

A - (общее число колонок выравнивания) -> 27
B - (число колонок с одинаковыми буквами) -> 14
PI - (процент идентичности) -> [B/A] * 100% = [14/27] * 100% = 51.85 %

Рассчитываем процент сходства двух последовательностей, используя матрицу сходства BLOSUM62:

A - (общее число колонок выравнивания) -> 27
B - (число колонок с одинаковыми буквами) -> 14
C - (число колонок с буквами, соответствующими сходным остаткам) -> 1 (колонка Q/R с положительным значением в матрице сходства)
PS - (процент сходства) -> [(B+C)/A] * 100% = [(14+1)/27] * 100% = 55.56 %

2. Построение карты локального сходства последовательностей из задания 1, пользуясь возможностями Excel

- заносим обе последовательности в таблицу Exele.

- чтобы вставить последовательность по букве в каждую ячейку мы можем написать формулу, используя функцию ПСТР (MID); или во вкладке "Данные" выбрать "Текст по столбцам", а для разбиения по строчкам выполнить тоже самое и затем транспонировать.

- для отметки совпадений букв цифрой "1" мы также можем написать формулу, используя функции СОВПАД (EXACT) и ЕСЛИ (IF).

Пояснения к таблице:

Не стоит сильно удивляться карте, которая получилась, так как при 50%-м сходстве мы и не должны ожидать чего-то большего, хотя и хотелось конечно...

Итак, перейдём к пояснениям:

- в идеале, подчёркиваю в идеале, мы должны были получить красивую диагональ из единиц, идущую слева направо, сверху вниз. А на нашей карте мы мало того что не видим красивой диагонали, мы и диагональ то видим с трудом... Но, что есть то есть.

- причина столь неидеальной карты сходства кроется в выравнивании этих двух последовательностей, где количество гэпов почти равно количеству колонок с одинаковыми буквами

- на карте мы видим что "диагональ" начинается лишь с соответствия L-L, перед которым остаётся приличный пробел из-за несоответствия букв R и F буквам I, Q и D из-за чего в выравнивании мы и видим эти гэпы.
Далее идёт один из двух самых лучших участков единиц, целых 4 подряд, следовательно на этом участке в выравнивании было соответствие букв.
Затем на карте мы наблюдаем резкий "обрыв" линии единиц из-за очередного несоответствия букв, на этот раз диагональ сдвинулась на четыре клетки вниз, что напрочь убило надежды на то что наша "диагональ" хоть немного приблизится к идеальной...
После этого идёт второй замечательный участок единиц, а вот дальнейшее продолжение настолько грустно и печально, что из-за обилия слова гэп в соответствующем описании, я решил закончить объяснении карты на последнем замечательном участке из 4-х единиц.

3. Выравнивание первого фрагмента из задания 1 с последовательностью белка THIS_BACSU, пользуясь программой bl2seq

Используя программу bl2seq, мы можем построить частичные выравнивания, но программу имеет смысл применять только для выравнивания одинаковых или очень сходных последовательностей, что мы собственно и делаем.

- переходим на сайт NCBI BLAST, где bl2seq реализована как сервис

- переходим по ссылке Align внизу страницы, а затем выбираем вкладку blastp (blast protein - выровнять белковые последовательности)

- далее в верхнее окошко ("Enter Query Sequence") копируем последовательность моего белка в fasta-формате, а в окошко "Enter Subject Sequence" вписываем первую последовательность из задания 1, которая является фрагментом последовательности моего белка

- нажимаем на большую синюю кнопку "BLAST" и получаем результат, из которого нам необходима только информация о выравнивании

>lcl|64185 unnamed protein product
Length=23

 Score = 77.4 bits (175),  Expect = 3e-24
 Identities = 23/23 (100%), Positives = 23/23 (100%), Gaps = 0/23 (0%)

Query  18  IQDLLASYQLENKIVIVERNKEI  40
           IQDLLASYQLENKIVIVERNKEI
Sbjct  1   IQDLLASYQLENKIVIVERNKEI  23

Из строчки "Query" делаем вывод, что координаты последовательности фрагмента в полной последовательности белка: 18 - 40.

4. Выравнивание последовательности моего белка с последовательностью гомологичного (родственного) белка, пользуясь сервисом bl2seq

- для выполнения этого выравнивания снова переходим на сайт NCBI BLAST с сервисом bl2seq

- теперь в окошко "Query" вписываем AC моего белка THIS_BACSU (O31617), а в "Subject" - ID его гомолога AP1G_DICDI (Q8I8U2).

Но, как оказалось, не всё так просто. Всеми любимый сервис bl2seq устроил нам небольшую проблему, не выдав на наш запрос ничего, хотя кое-что он всё-таки предоставил...

fail

Я просто не могу не прокомментировать полученный результат, хоть результатом это и трудно назвать...

Во-первых, он (сервис) всё-таки понял, что необходимо выровнять две последовательности, это не может не радовать:)

Во-вторых, он дважды написал о предупреждении, непонятно только для чего.

В-третьих, он таки не смог найти каких-либо существенных сходств у последовательностей.

Но на этом мы не остановились, так как выровнять нам их в любом случае нужно.

- запишем в соответствующие окошки не идентификаторы, а напрямую сами последовательности белков в fasta-формате

- на этот раз сервис "сдался" и выдал нам то что нужно:

>lcl|32701 unnamed protein product
Length=895

 Score = 30.4 bits (67),  Expect = 5e-06, Method: Composition-based stats.
 Identities = 14/45 (31%), Positives = 25/45 (56%), Gaps = 0/45 (0%)

Query  18   IQDLLASYQLENKIVIVERNKEIIGKERYHEVELCDRDVIEIVHF  62
            + DL  +Y  + K ++ ERN  +I       +E+C+ D  +I+HF
Sbjct  166  VPDLTENYIPKIKALLSERNHAVILTALTLIIEICEMDSTQIIHF  210

Но, честно говоря, многим сервис нас не обеспечил, как минимум описанием обоих белков.

description

На самом деле для задания необходимо лишь само выравнивание и информация о нём, поэтому ограничимся тем, что есть.

ID	THIS_BACSU	AP1G_DICDI
Организм, из которого синтезирован белок	Bacillus subtilis (Сенная палочка)	Dictyostelium discoideum (Slime mold - плесень покрытая слизью)
Процент идентичности (Identities)	31 %
Процент сходства (Positives)	56 %
Число символов разрыва (гэпов)	0
Число символом разрыва, идущих подряд
Суммарное число гэповых колонок
Координаты выровненного участка	18-62	166-210

Нажав на "Dot Matrix View" нам раскрывается вкладка с картой локального сходства, которую мы сохраняем в виде gif-файла:

5*. Создание матрицы, в ячейке которой стоит вес замены соответствующих остатков в строке и столбце, для
последовательностей из задания 1

- для выполнения задания веса берём из матрицы весов замен BLOSUM62

- строим матрицу, используя Exele

	I	Q	D	L	L	A	S	Y	Q	L	E	N	K	I	V	I	V	E	R	N	K	E	I
R	-3	1	-2	-2	-2	-1	-1	-2	1	-2	0	0	2	-3	-3	-3	-3	0	5	0	2	0	-3
F	0	-3	-3	0	0	-2	-2	3	-3	0	-3	-3	-3	0	-1	0	-1	-3	-3	-3	-3	-3	0
L	2	-2	-4	4	4	-1	-2	-1	-2	4	-3	-3	-2	2	1	2	1	-3	-2	-3	-2	-3	2
L	2	-2	-4	4	4	-1	-2	-1	-2	4	-3	-3	-2	2	1	2	1	-3	-2	-3	-2	-3	2
A	-1	-1	-2	-1	-1	4	1	-2	-1	-1	-1	-2	-1	-1	0	-1	0	-1	-1	-2	-1	-1	-1
S	-2	0	0	-2	-2	1	4	-2	0	-2	0	1	0	-2	-2	-2	-2	0	-1	1	0	0	-2
D	-3	0	6	-4	-4	-2	0	-3	0	-4	2	1	-1	-3	-3	-3	-3	2	-2	1	-1	2	-3
G	-4	-2	-1	-4	-4	0	0	-3	-2	-4	-2	0	-2	-4	-3	-4	-3	-2	-2	0	-2	-2	-4
T	-1	-1	-1	-1	-1	0	1	-2	-1	-1	-1	0	-1	-1	0	-1	0	-1	-1	0	-1	-1	-1
G	-4	-2	-1	-4	-4	0	0	-3	-2	-4	-2	0	-2	-4	-3	-4	-3	-2	-2	0	-2	-2	-4
Q	-3	5	0	-2	-2	-1	0	-1	5	-2	2	0	1	-3	-2	-3	-2	2	1	0	1	2	-3
L	2	-2	-4	4	4	-1	-2	-1	-2	4	-3	-3	-2	2	1	2	1	-3	-2	-3	-2	-3	2
E	-3	2	2	-3	-3	-1	0	-2	2	-3	5	0	1	-3	-2	-3	-2	5	0	0	1	5	-3
N	-3	0	1	-3	-3	-2	1	-2	0	-3	0	6	0	-3	-3	-3	-3	0	0	6	0	0	-3
I	4	-3	-3	2	2	-1	-2	-1	-3	2	-3	-3	-3	4	3	4	3	-3	-3	-3	-3	-3	4
V	3	-2	-3	1	1	0	-2	-1	-2	1	-2	-3	-2	3	4	3	4	-2	-3	-3	-2	-2	3
E	-3	2	2	-3	-3	-1	0	-2	2	-3	5	0	1	-3	-2	-3	-2	5	0	0	1	5	-3
V	3	-2	-3	1	1	0	-2	-1	-2	1	-2	-3	-2	3	4	3	4	-2	-3	-3	-2	-2	3
R	-3	1	-2	-2	-2	-1	-1	-2	1	-2	0	0	2	-3	-3	-3	-3	0	5	0	2	0	-3
K	-3	1	-1	-2	-2	-1	0	-2	1	-2	1	0	5	-3	-2	-3	-2	1	2	0	5	1	-3
E	-3	2	2	-3	-3	-1	0	-2	2	-3	5	0	1	-3	-2	-3	-2	5	0	0	1	5	-3

6*. Сравнение выравниваний последовательностей из задания 4, построенных с разными параметрами программы
bl2seq

- на этот раз перед тем как нажать на кнопку "Blast" и произвести выравнивание, мы откроем вкладку "Algorithm parameters", которая находится как раз под кнопкой начала выравнивания

- открыв её, изменим матрицу BLOSUM62 на матрицу PAM30 в разделе "Scoring Parameters". Мы получили два участка выравнивания вместо одного как было ранее, и на втором участке, например, процент идентичности увеличился до 60%, а сходства до 100%

- произведя то же выравнивание, но уже с матрицей BLOSUM80, процент идентичности останется равным 31% как и было с матрицей BLOSUM62, а процент сходства уменьшится до 53%

- изменив штрафы за гэпы, никаких изменений мы не увидим, так как в нашем выравнивании гэпов нет

Чтобы определить насколько одинаковы два выравнивания (одних и тех же последовательностей), можно использовать процент согласованных столбцов двух выравниваний относительно числа столбцов в каждом из выравниваний. В данном случае при изменении матрицы BLOSUM62 на BLOSUM80 процент согласованных столбцов равен [(A/B)*100%] = [(24/25)*100%] = 96% (где A - число столбцов с одинаковыми буквами для матрицы BLOSUM80, а B - для матрицы BLOSUM62).

7*. Импорт последовательности, которую мы выравнивали в обязательном упражнении 4, в GeneDoc.
Воспроизведение вручную выравнивания, полученного программой bl2seq.

Посмотрим выравнивание последовательностей, выполненное при помощи сервиса bl2seq:

Программа bl2seq выдала нам частичное выравнивание, а нам нужно сделать полное, поэтому мы импортируем последовательности обоих белков в GeneDoc и против всех остатков, не вошедших в частичные выравнивания, вручную ставим гэпы.

Добавив гэпы, мы получили дополнительно 9 соответствий букв L-L, D-D, A-A, Q-Q, R-R, K-K, E-E, R-R, V-V. Это увеличило процент идентичности и сходства выравниваемых последовательностей и, следовательно, дало нам более полное выравнивание.