Практикум 3. Предсказание вторичной структуры тРНК и анализ ДНК-белковых взаимодействий
Задание 1. Предсказание вторичной структуры заданной тРНК
Для исследования была выбрана фенилаланиновая тРНК дрожжей, экспериментальная структура которой представлена в PDB под идентификатором 1EHZ.
В ходе работы проводилось сравнение экспериментальной вторичной структуры
тРНК с результатами предсказания программами einverted из пакета
EMBOSS и ViennaRNA.
1.1. Предсказание с помощью einverted
Программа einverted использовалась для поиска инвертированных
повторов в последовательности тРНК. Для анализа были использованы
следующие параметры:
- Gap penalty: 12
- Minimum score threshold: 10
- Match score: 3
- Mismatch score: −3
Программа обнаружила отдельные комплементарные участки, в том числе соответствующие антикодоновому и TΨC-стеблям. Однако полная вторичная структура тРНК с помощью данного метода восстановлена не была.
1.2. Предсказание с помощью ViennaRNA
Для предсказания вторичной структуры также использовалась библиотека
ViennaRNA, реализующая алгоритм поиска структуры с минимальной
свободной энергией.
Полученная минимальная свободная энергия составила −22,4 ккал/моль. Предсказанная структура содержала 21 пару оснований и включала основные стебли тРНК.
Рисунок 1. Предсказание вторичной структуры фенилаланиновой тРНК с помощью ViennaRNA.
1.3. Сравнение результатов
Для сравнения использовались экспериментальная структура 1EHZ,
результаты программы einverted и предсказание ViennaRNA.
| Стебель | Экспериментальная структура | ViennaRNA |
|---|---|---|
| Акцепторный | 1–7 / 66–72 | 1–7 / 66–72 |
| D-стебель | 10–13 / 22–25 | 10–13 / 22–25 |
| Антикодоновый | 26–30 / 40–44 | 27–31 / 39–43 |
| TΨC-стебель | 49–53 / 61–65 | 49–53 / 61–65 |
Таблица 1. Сравнение положения стеблей в экспериментальной и предсказанной структурах тРНК.
ViennaRNA воспроизвела расположение акцепторного, D- и TΨC-стеблей.
В антикодоновом стебле наблюдалось смещение предсказанных пар оснований.
Программа einverted обнаружила отдельные инвертированные повторы,
однако её результаты не позволили полностью восстановить клеверную структуру тРНК.
Задание 2. Поиск ДНК-белковых контактов в заданной структуре
Для анализа был выбран комплекс λ-репрессора с операторной ДНК 1LMB.
Упражнение 1. Визуализация в PyMOL
С помощью PyMOL была проведена визуализация комплекса ДНК с белком. Были выделены три набора атомов:
- Set1 — атомы кольцевого кислорода O4' дезоксирибозы.
- Set2 — атомы кислорода OP1 и OP2 фосфатных групп.
- Set3 — атомы азота азотистых оснований.
Был создан скрипт PyMOL, позволяющий последовательно визуализировать весь комплекс, только ДНК и выделенные наборы атомов.
Рисунок 2. Выделение атомов ДНК в PyMOL. Красным обозначен кислород дезоксирибозы, оранжевым — кислород фосфатных групп, синим — азот оснований.
Упражнение 2. Расчёт ДНК-белковых контактов
На основе атомных координат комплекса был проведён расчёт контактов между ДНК и белком. Использовались следующие критерии:
- Полярные контакты: расстояние между атомами O/N и O/N не более 3,5 Å.
- Неполярные контакты: расстояние между атомами C/P/S и C/P/S не более 4,5 Å.
| Область ДНК | Полярные | Неполярные | Всего |
|---|---|---|---|
| Дезоксирибоза | 0 | 18 | 18 |
| Фосфатные группы | 19 | 17 | 36 |
| Азотистые основания | 18 | 43 | 61 |
| Итого | 37 | 78 | 115 |
Таблица 2. Количество контактов между атомами ДНК и λ-репрессора.
В исследованной структуре было обнаружено 115 контактов: 37 полярных и 78 неполярных. Наибольшее количество контактов обнаружено с азотистыми основаниями ДНК — 61. Все 18 полярных контактов с основаниями приходятся на атомы, обращённые в большую борозду.
Упражнение 3. Анализ с помощью Nucplot
С помощью программы Nucplot была получена схема
ДНК-белковых взаимодействий в комплексе 1LMB.
Для корректного распознавания нуклеотидов программой была подготовлена модифицированная копия PDB-файла с изменёнными обозначениями остатков ДНК. Атомные координаты при этом не изменялись. Полученная схема была преобразована в формат PDF.
Схема ДНК-белковых контактов Nucplot
При построении схемы возникло предупреждение об отсутствии вспомогательной
программы hbadd, поэтому отображение водородных связей может
быть неполным.
Упражнение 4. Анализ отдельных аминокислотных остатков
Для определения аминокислот, наиболее активно взаимодействующих с ДНК, были подсчитаны контакты каждого остатка с атомами ДНК. Наибольшее количество обнаружено у лизина в положении 3 белковой цепи 4 (LYS3). Данный остаток образует 18 контактов: 3 полярных и 15 неполярных.
Среди обнаруженных полярных взаимодействий:
- NZ — O6 гуанина DG11: 2,57 Å.
- O — N4 цитозина DC12: 3,15 Å.
- NZ — O6 гуанина DG30: 2,99 Å.
Рисунок 3. Полярные контакты LYS3 белковой цепи 4 с нуклеотидами ДНК. Пунктиром показаны расстояния между атомами.
Дополнительно был рассмотрен глутамин в положении 44 белковой цепи 3 (GLN44). Он образует шесть контактов с двумя соседними основаниями ДНК: тимином DT3 и аденином DA4. С аденином обнаружены два полярных контакта:
- NE2 — N7: 3,32 Å.
- OE1 — N6: 3,12 Å.
С тимином зарегистрированы четыре неполярных контакта.
Рисунок 4. Взаимодействия GLN44 белковой цепи 3 с аденином DA4. Пунктиром показаны расстояния между атомами.
Взаимодействие GLN44 непосредственно с двумя соседними основаниями позволяет предположить его участие в распознавании операторной последовательности ДНК.