Построение профиля подсемейства

Рисунок 1. Дерево представителей "хорошего" подсемейства,
построенное методом Neighbor-Joining c Bootstrap-тестом (100 реплик)
Для создания профиля из выравнивания, полученнного в предыдущем практикуме в отдельный файл profile.fasta были извлечены представители, составляющие "хорошее" подсемейство. Таким оказалось подсемейство из представителей таксона Metazoa с доменной архитектурой 2 (Рис. 1).

Для построения и калибровки профиля применялся пакет HMMER, установленный на kodomo.
Использовались следущие команды:

Построение профиля: hmm2build profile1 profile.fasta
Калибровка:hmm2calibrate profile1

Полученный файл: profile1



После этого был произведен поиск по всем белкам UniProt, содержащим домен AMPK1_CBM.
Использованная команда: hmm2search profile1 PF16561_full_length_sequences.fasta >> output
Полученный файл: output

Рисунок 2. Гистограмма весов находок
Рисунок 3. ROC-кривая
Результаты поиска были перенесены в файл Excel и отсортированы по убыванию нормализованного веса. Всего было получено 2839 находок, среди которых были отмечены представители нашего подсемейства (1 в колонке Profile, если находка принадлежит подсемейству, и 0 в противном случае). Затем были вычислены показатели чувствительности и специфичности.

По имеющимся данным были построены гистограмма весов находок (Рис. 2) и ROC-кривая (Рис. 3).

Итоговый Excel-файл: roc.xlsx

На основании построенной ROC-кривой было выбрано пороговое значение E-value. Критерием выбора являлось максимальное значение разности [Чувствительность - (1-Специфичность)]. Полученный порог E-value - 1,3E-51. При таком пороге чувствительноть профиля составляет 1,0000000, а специфичность 0,92117356. Это достаточно хорошие значения, поэтому построенный профиль вполне можно использовать для выделения подсемейства.












Далее все имеющиеся находки были разделены по принципу выше/ниже порога, и среди каждой группы были выделены представители, принадлежащие и не принадлежащие подсемейству. Полученные результаты представлены в таблице 1.
На самом делеПринадлежит
подсемейству		Не принадлежитСумма
Выше порога по профилю
(включая порог)		9224233
Ниже порога026062606
Сумма928302839
Таблица 1. Разделение находок при пороге E-value 1,3E-51

Поиск гомологов с помощью psi-BLAST

PSI-BLAST (Position-Specific Iterative Basic Local Alignment Search Tool) предназначен для сравнения изучаемой аминокислотной последовательности белка с имеющейся базой данных с целью поиска последовательностей, обладающих незначительным сходством. Его алгоритм состоит из множества итераций, в каждой из которых из списка последовательностей строится множественное выравнивание, из котрого затем извлекаются блоки для построения PSSM (Position-Specific Scoring Matrix).

Рисунок 4. Число находок PSI-BLAST после первой итерации
Рисунок 5. Выдача PSI-BLAST после последней итерации
С помощью PSI-BLAST мною был произведен поиск гомологов белка WP_003452659.1, который я изучала в первом семестре. Этот белок является N-манозамин-6-фосфат 2-эпимеразой бактерии Clostridium perfringens.

Для данного белка был запущен PSI-BLAST с дефолтными параметрами по банку SwissProt. Сервис сработал достаточно быстро и после первой итерации выдал 410 находок (Рис. 4), из которых 111 имели E-value лучше порогового, а 299 - хуже. E-value худшей из "хороших" находок составил 0.004, а лучшей из "плохих" - 0.005, что согласуется с заданными по дефолту параметрами (PSI-BLAST Threshold = 0.005). E-value самой хорошей находки - 2e-162. Все 111 "хороших" последоваетльностей были выбраны для PSI-BLAST (галочка в поле Select for PSI blast), но ни одна из находок не была использована для построения PSSM (нет галочки в поле Used to build PSSM), что логично, так как это была только первая итерация.

Затем с выбранными "хорошими" находками была запущена вторая итерация, опять же с дефолтными параметрами (Run PSI-Blast iteration 3 with max 500). При этом, как и было задано, нашлось 500 последовательностей, все из них были выбраны для PSI-BLAST, но далеко не все из них были отмечены зеленой галочкой как "правильные" и использованы для построения PSSM. Желтым цветом были отмечены последовательности с весом ниже порогового на основании предыдущей итерации. Последовательностей, использованных для построения PSSM оказалось 109, лучшая из них имела E-value 8e-120, а худшая - 2e-20.

После третьей итерации из 500 находок уже только 12 были выделены желтым, а 488 - использованы для построения PSSM. Худший E-value использованной находки - 7e-54, лучший - 9e-100.

После четвертой итерации желтым оказались выделены лишь 7 находок из 500, а для PSSM использовались 493. E-value худшей из них - 4e-62, лучшей - 2e-101.

После пятой итерации желтым были выделены 2 находки. Для PSSM исползовались 488, среди них лучший E-value - 4e-109, худший - 6e-61.

Шестая итерация вопреки моим ожиданиям выдала больше "плохих" находок - 6. Соответсвенно для PSSM были испоьзованы 494. Худший E-value из использованных находок - 6e-61, то есть такой же, как и в предыдущей итерации. Лучший - 6e-108.

После седьмой итерации число выделенных желтым находок опять увеличилось до 12, для PSSM были использованы 488 находок, худший E-value из них - 6e-66, лучший - 1e-107.

Восьмая итерация - вновь увеличение числа "плохих" находок - 18. Для PSSM использованы 482, из них худший E-value - 6e-70, лучший - 4e-109.

На данном этапе можно заметить следующую тенденцию: E-value худшей из использованных для PSSM находки для каждой последующей итерации становится ниже. Что-то однозначно сказать о поведении E-value лучшей находки и числе находок, использованных для PSSM нельзя. В начале произолшо явное падение числа "плохих" (выделенных желтым) находок, но потом их число вновь стало постепенно расти.

ИтерацияПлохие/Хорошие
910/490
1010/490
1117/483
1214/496
Таблица 2. Число находок
в итерациях 9-12
Далее мною была проведена серия итераций без подробной записи параметров с целью добиться стабилизации соотнощения "плохих" и "хороших" находок. Результаты представлены в таблице 2.

Стоит отметить, что с каждой следующей итерацией время работы программы несколько увеличивалось, особенно это стало заметно между 11 и 12 итерациями. 11 длилась приблизительно 3 минуты, а вот выполнение 12 составило аж 36 минут. Поэтому она и стала для меня последней.

Данные последней итерации: "хороших" находок - 496, "плохих" - 14, E-value лучшей находки, использованной для PSSM - 5e-119, худшей - 2e-80. E-value худшей находки, использованной для PSSM, и здесь оказался ниже, чем на предыдущих шагах, что согласуется с отмеченной тенденцией. Стабилизации списка мне добиться не удалось. Тем не менее, в целом работа с PSI-BLAST оставляет приятное впечатление