Восстановление кристалла из PDB файла
Задание 1. Описание взаимодействий белка флавин-зависимой тимидилатсинтазы ThyX с белками из соседних ячеек
В этом задании продолжаем работать с тем же белком, что и в прошлом практикуме, - с флавин-зависимой тимидилатсинтазой ThyX из вируса Paramecium bursaria Chlorella virus 1 (PDB ID: 2CFA). Белок представляет собой гетеротетрамер с формулой A2B2 (биологическая единица), а в файле 2cfa.pdb содержится только гетеродимер АВ (асимметрическая единица). Также в файле 2cfa.pdb в поле CRYST1 содержится информация об элементарной кисталлографической ячейке структуры:
CRYST1 69.264 76.991 93.437 90.00 90.00 90.00 P 21 21 2 4
Первые три числа в этой записи (69.264 76.991 93.437) - длины образующих элементарную ячейку векторов а, b и c в ангстремах (Å); вторые три числа (90.00 90.00 90.00) - значения углов α, β и γ между этими векторами в градусах (°). Таким образом, наша ячейка ортогональна. P 21 21 2 - обозначение кристаллографической группы симметрии по символике Германа-Могена. И, наконец, последнее число в этой строке (4) - число молекул (цепей) в элементарной кристаллографической ячейке. Интересно, что, как гласит мануал, для гетерополимерных белков последнее число отражает количество в элементарной ячейке молекул самого распространенного типа цепи. То есть в нашем случае элементарная ячейка содержит по 4 цепи А и В - 4 асимметричные ячейки, но всего 8 цепей.На Рис. 1 изображена биологическая единица белка - гетеротетрамер, темно-красным цветом обозначена асимметрическая ячейка - гетеродимер.
На Рис. 2 представлен фрагмент кристалла, полученный отображением ячеек, близких к асимметрической (показана ярко-красным цветом). Кубический каркас выделяет элементарную кристаллографическую единицу. Она расположена очень интересно, захватывая лишь часть асимметрической единицы, но это нормальный вариант, так бывает.
Контакты белка с соседними ячейками
На Рис. 3 показаны асимметрические единицы, соседние с исходной (ярко-желтого цвета). Различными цветами обозначены цепи или пары цепей, которые по-разному контактируют с исходной единицей. Цепи, обозначенные ярко-красным и салатовым цветами, находятся довольно далеко от исходной цепи и не демонстрируют никаких контактов с ней. Поэтому при более детальном изучении контактов они рассматриваться не будут.
Поэтому всего получается 4 зоны контактов: серая (тетрамеризация), зеленая, фиолетовая, голубая.
Контакты при образовании тетрамера - биологической единицы
Для начала восстановим ближайшую соседнюю ячейку для асимметрической ячейки нашего белка. Вместе эти ячейки составляют биологическую единицу, поэтому контакты, которые мы между ними найдем, с большой вероятностью будут иметь гарантированный биологический смысл.
Рассмотрим в первую очередь водородные связи. Они могут возникать как непосредственно между полярными аминокислотными остатками из различных цепей, так и опосредоваться молекулами воды, образуя водяные мостики. Поэтому для поиска полярных контактов были выделены полярные атомы боковых цепей белков из обеих ячеек, а также соседствующие с ними молекулы воды.
Всего между цепями было обнаружено 22 водородных связи и 5 водных мостиков (Рис. 4), что позволяет предположить, что именно полярные контакты вносят большой вклад в образование функционально активного тетрамера.
 |
 |
Однако в статье, к которой привязана расшифровка данной структуры, говорится, что основной вклад в образование тетрамера (который, к слову, они в статье называют гомотетрамером - расхождение с информацией на сайте PDB) вносят стекинг-взаимодействия между альфа-спиралями в core димеров, а также гидрофобные взаимодействия между длинными альфа-спиралями по краям димеров.
Действительно, в области контакта крайних длинных альфа-спиралей находится довольно много гидрофобных боковых цепей (Рис. 5). Что касается полярных контактов, теперь неясно, вносят ли они вклад в образование тетрамера или особенностью кристаллизации.
Контакты между другими ячейками
Рассмотрим в первую очередь полярные контакты между исходной единицей и остальными контактирующими ячейками аналогично предыдущему пункту. В каждом типе зон контактов обнаружено немного водородных связей (4-5), зеленая и голубая цепи также связаны с исходной единицей через один водный мостик каждая (Рис. 6). Ввиду наличия молекул воды в каждой зоне контакта, искать гидрофобные взаимодействия не имеет смысла. В литературе никакой информации об олигомеризации, помимо тетрамеризации, я не нашла, поэтому будем считать, что найденные полярные контакты отражают лишь особенности кристаллизации, а не природные взаимодействия белков.
 |
 |
 |
Задание 2. Описание странного расположения белковых цепей в структуре ДНК-белкового комплекса
Для выполнения этого задания была взята структура комплекса гомеодомена с ДНК (PDB ID: 3HDD). Эта структура примечательна тем, что содержит гомеодомен, неестественно расположенный на краю ДНК (Рис. 7 слева). Однако если восстановить соседнюю асимметрическую ячейку, то видно, что "свисающий" гомеодомен на самом деле контактирует с ДНК из соседней ячейки (обозначена синим цветом) (Рис. 7 справа).
 |
 |
Если дополнительно визуализировать полярные контакты между гомеодоменом и ДНК аналогично предыдущему заданию (Рис. 8), то видно, что белок взаимодействует с ДНК из обеих ячеек, правда, с ДНК из своей ячейки (серая) несколько больше, чем из соседней (синяя): между белком и ДНК из соседней ячейки только один водный мостик, а из своей - несколько.
Задание 3. Примеры PDB файлов, асимметрическая единицы которых не совпадает с биологической единицей
Асимметрическая единица - минимальный участок структуры, с помощью которого путем кристаллографической симметрии можно восстановить весь кристалл. Биологическая же единица несет информацию о том, в какой форме белок находится в физиологических условиях. Так как первое понятие имеет только структурный смысл, а второе - биологический, то возможны несовпадения. Для поиска случаев несовпадения удобно пользоваться advanced search в PDB по полям number of chains (asymm. unit) и number of chains (Biol. assembly), делая их различающимися в зависимости от того, какой случай хотим увидеть.
Информацию о биологической единице можно почерпнуть несколькими способами. Во-первых, с сайта PDB: слева в окне Biological Assembly в строке Protein Stoichiometry. Во-вторых, в PDB-файле в полях REMARK 300 и REMARK 350.
Пример 1. Асимметрическая единица содержит больше цепей, чем биологическая.
Для поиска задавала number of chains (asymm. unit) не меньше 2, а number of chains (Biol. assembly) - не больше 1.
Из результатов поиска я выбрала структуру бета-фосфоглюкомутазы из организма Lactococcus lactis (PDB ID: 5OLW). Асимметрическая единица этого белка содержит две цепи, тогда как в функциональном отношении белок является мономером (обозначены разными цветами на Рис. 9), то есть биологическая единица содержит только одну из цепей. Об этом можно было узнать из PDB-файла:
REMARK 350 AUTHOR DETERMINED BIOLOGICAL UNIT: MONOMERIC
Пример 2. Асимметрическая единица содержит меньше цепей, чем биологическая.
Условия поиска обратны предыдущему примеру: number of chains (asymm. unit) не больше 1, а number of chains (Biol. assembly) - не меньше 2.
Условиям удовлетворяет структура частично окисленной глутатион-S-трансферазы Tau 23 из организма Arabidopsis thaliana (PDB ID: 5O84). Асимметрическая единица данной структуры содержит одну цепь, а окно Biological Assembly на сайте PDB сообщает нам, что в биологическая единица - димер:
Protein Stoichiometry: Homo 2-mer - A2
В этом случае чтобы показать биологическую единицу, необходимо восстанавливать соседние ячейки способом, упомянутым выше. Однако в таких случаях не всегда легко понять, какая именно из добавленных ячеек составляет димер с исходной. Можно варьировать порог расстояния, пока не будет оставаться только одна добавочная ячейка. Но есть и способ себя проверить. Структуру биологической единицы заботливо приводят на сайте PDB: справа в окне Biological Assembly в строке Protein Symmetry можно пройти по ссылке (View in 3D).На Рис. 10 представлена биологическая единица глутатион-S-трансферазы Tau 23, асимметрическая единица показана ярко-зеленым.
