Задание 1. Оценка давления отбора на ген белка DHAS_ECOLI

#1

Для выполнения задания был использован белок DHAS_ECOLI (аминокислотная и нуклеотидная последовательности)
Программой BLASTP был найден вероятный ортолог — Q9KQG2_VIBCH. Предположение о ортологичности вынесено на основании сочетания самого высокого в выдаче BLASTP процента совпадений (66%) и полного совпадения описания с описанием DHAS_ECOLI. (аминокислотная и нуклеотидная последовательности Q9KQG2_VIBCH).

Холерный вибрион имеет два разных работающих гена аспартат-дегидрогеназы. Q9KQG2_VIBCH и Q93LQ5_VIBCH. Гены отличаются по двум позициям: произошла перестановка в 1085й и 1086й позиции, в результате чего в 1м белке экспресируется L, а во 2м — V.

#2

С помощью программы needle были выполнены выравнивания белковых и нуклеотидных последовательностей. Белковое выравнивание далось «малой кровью» со стандартными параметрами. С нуклеотидным выравниванием было сложнее, поскольку при стандартных параметрах (Gap penalty: 10.0 Extend penalty: 0.5) в выравнивании было большое количество гэпов, к тому же с длиной не кратной трем, т.е. рамка считывания "скакала". Постепенное повышение штрафа за открытие гэпа количество гэпов в начале и середине было приведено к минимуму с целью большего соответствия белковому выравниванию, поскольку в нем они в начале и середине отсутствуют (кроме одного, о котором ниже). Это привело к подбору наиболее, на мой взгляд, оптимальных параметров: Gap penalty: 30.0 Extend penalty: 1.0. Правда, имеется локальный сдвиг рамки считывания в районе 770 нуклеотида. При этом отсутствуют какие-либо проявления этого сдвига (гэпы) )в белковом выравнивании. Это единственное серьезное различие между белковым и нуклеотидным выравниваниями.

#3 PAL2NAL

PAL2NAL – это программа, которая конвертирует множественные белковые выравнивания и соответствующую последовательность ДНК (или мРНК) в выравнивание кодонов. Программа автоматически приписывает соответствующий кодон последовательности, даже в том случае, когда последовательность ДНК имеет несовпадения с белковой последовательностью, содержит UTR или polyA хвосты. Она может даже справиться с сдвигами рамки во входном выравнивании, что походит для анализа псевдогенов. Выходное выравнивание кодонов может быть использовано для подсчета синонимичных и несинонимичных замен. (Дословный перевод описания с сайта программы)

Программа PAL2NAL позволяет провести сравнение нуклеотидного и белкового выравнивания:

PAL2NAL
                E   E   W   K   G   Q   A   E   T   N   K   I   L   N   -   T   S   S   V   I
DHAS_ECOLI      gaa gag tgg aaa ggg cag gcg gaa acc aac aag atc ctc aac --- aca tct tcc gta att
                E   E   W   K   A   G   V   E   A   N   K   I   L   G   L   Q   D   S   P   V
Q9KQG2_VIBCH    gaa gag tgg aaa gcg ggt gta gaa gcc aac aaa att ctg ggt ttg caa gat tct cca gta


Needle

V00262   751  aagatcct------ caacacatcttccgtaattccggtagatggtttat    793
              ||.||.||       |||.|    |||...|.|.|||.|.||||||...|
AAF95184 748  aaaattctgggtttgcaaga--- ttctccagtaccgattgatggtacgt    793 

Красным выделены различия. Они подтверждают предположение что needle выровнял последовательности не точно.


Полное выравнивание PAL2NAL.


Для подсчета Ka и Ks необходимо поставить флажки у пунктов: Calculate KS and KA: Yes и Remove gaps, inframe stop codons
Для моего выравнивания были получены следующие значения констант:
KS = 3.6920
KA = 0.2870
KA/KS = 0.0777 (<< 1)
Отбор отрицательный (стабилизирующий).

Программа PAL2NAL показала себя как удобный инструмент для сравнения нуклеотидных и белковых выравниваний: она сильно облегчает сравнение нуклеотидных и белковых выравниваний. И еще она делает "грязную работу" по подсчету Ka и Ks.

#4 Оценка давления эволюционного отбора на обонятельные рецепторы человека

Для выполнения задания был проведен поиск по базам данных UniProtKB и Swiss-Prot по ключевым словам "olfactory receptors" и "human". Из находок была выбрана запись O51E2_HUMAN — olfactory receptor 51E2 (prostate specific G-protein coupled receptor). Далее было решено найти программой BLASTP ортологов в шимпанзе (Pan troglodytes).
В выдаче BLASTP подавляющее число находок имели описание данное на основе сравнения с белками человека:
первые 2ве записи имели 99% соответствие белку O51E2_HUMAN (различие по одной позиции), это говорит о том что этот белок практически не изменился с ходом эволюции, то есть отбор сильный стабилизирующий.
Для дополнительного анализа был выбран белок AC: AF546234 из той же выборки BLASTP. Критерием было отсутствие в описании слова predicted. В описании есть заметка:

7 transmembrane receptor (rhodopsin family). This family contains, amongst other G-protein-coupled receptors (GCPRs), members of the opsin family, which have been considered to be typical members of the rhodopsin superfamily; pfam00001.

Тоесть этот белок в первом приближении можно считать ортологом. (Совпадений 45%, выравнивание).
Выравнивание needle, стандартные параметры.
Нуклеотидные последовательности: O51E2_HUMAN и AF546234.

Для подсчета Ka/Ks использовался PAL2NAL:

Ks = 30.3847
Ka = 0.4275
Ka/Ks = 0.0141 (<<1)

В итоге оба белка подтверждают гипотезу о стабилизирующим отборе.