Анализ и картирование чтений выполнялось по схеме, описанной в практикуме 11[1]. Для удобства представлю его в виде таблицы:

Шаг	Команда	Дополнительно
Анализ качества данных однонуклеотидных чтений	>fastqc chr11_2.fastq	Результат доступен по ссылке: FastQC11_2-report
Очистка чтений (качество не ниже 20 с конца кажого чтения + ограничения по длине)	>java -jar /usr/share/java/trimmomatic.jar SE -phred33 chr11_1.fastq trimmed11_1.fastq LEADING:20 TRAILING:20 MINLEN:50	Осталось 33893, вырезано 357 ридов
Анализ качества очищенных чтений	>fastqc trimmed11_2.fastq	Результат доступен по ссылке: FastQC11_2_trimmed-report

Сравнение результатов до и после очистки некачественных ридов. Из рис. 1 и 2 видно, что качество ридов было хорошоим и до очитки, так как риды не выходили за пределы зеленой зоны, после очистки качество всё же немного улучшилось, поэтому будем использовать улучшенный файл.


Рис.1 и 2 "Per base sequence quality" до и после обработки ридов в программе Trimmomatic.

Картирование чтений включало в себя индексацию референсной последоваельности и построение выравниваний прочтений и референса в формате .sam.
* - подробнее об этом шаге можно прочитать в отчете о выполнении практикума 11: pr11. В частности, для выполнения этой команды использовались те же индексные файлы.
** - в отличие от практикума 11, в этом случае не использовался параметр "--no-spliced-alignmet": при анализе транскриптомов нужно учитывать сплайсинг, поэтому нужно разрешить разрывы.

Анализ выравнивания
Были последовательно выполнены следующие команды:

Команда	Функция
samtools view -b align11_2.sam -o align11_2.bam	Переводит выравнивание (референс + чтения) из формата .sam в бинарный формат .bam
samtools sort align11_2.bam -T align11_2.txt -o align11_2_sorted.bam	Сортирует выравнивание по коортинате референса в начале чтения
samtools index align11_2_sorted.bam	Индексирует полученный после сортировки .bam-файл
samtools idxstats align11_2_sorted.bam >idxstats11_2.txt	Подсчитывет количество чтений, откартированных на геном и выводит результат в файл idxstats11_2.txt

В результате проведенных опрераций 33625 чтений картировались на геном, 268 - нет.

Подсчёт чтений с помощью Bedtools
Для того чтобы выяснить какие гены и насколько глубоко оказались покрыты чтениями, я вырлнила команды, представленные в таблице ниже.

Команда	Функция
/P/y14/term3/block4/SNP/bedtools2/bin/bedtools bamtobed -i align11_2_sorted.bam > reads11_2.bed	.bam файл переводится в .bed файл (в него кладутся координаты выровненных ридов)
/P/y14/term3/block4/SNP/bedtools2/bin/bedtools intersect -a /P/y14/term3/block4/SNP/rnaseq_reads/gencode.genes.bed -b reads11_2.bed -c > overlap11_2.bed	На выходе получаем файл .bam формата с пересечением разметки генов с получееными координатами
sort -k 6 -r overlap11_2.bed > sort_overlap11_2.bed	Сортировка файла, полученного в предыдущем шаге

Проанализировав выходной файл sort_overlap11_2.bed, я пришла в выводу, что мои прочтения в оновном попали в границы гена HSPA8, а также snoРНК SNORD14D и SNORD14С. HSPA8 - это ген белка теплового шока "heat shock protein family A (Hsp70) member 8", а snoРНК - это малые ядрошковые РНК, класс малых РНК, которые обычно участвуют в метилировании и псевдоудилировании рибосомных РНК. В моем случае это SNORD14D и SNORD14С snoРНК.

Упражнения по bedtools