Практикум 12

Хромосома № 8

Часть 1.

Таблица 1. Использованные команды
cp Human/rnaseq_reads/chr8.2.fastq sofyagdk26/12_rna_chr8_2.fastq Копирование файла с транскриптомными ридами
java -jar /nfs/srv/databases/ngs/suvorova/trimmomatic/trimmomatic-0.30.jar SE -phred33 12_rna_chr8_2.fastq 12_chr8_trimmed.fastq TRAILING:20 MINLEN:50 TrimmomaticSE: Started with arguments: -phred33 12_rna_chr8_2.fastq 12_chr8_trimmed.fastq TRAILING:20 MINLEN:50 Триммирование чтений
fastqc 12_chr8_trimmed.fastq Запуск анализа FastQ - потом в html файл за анализом
hisat2 -x indexed -U 12_chr8_trimmed.fastq -S 12_chr8_altoref.sam --no-softclip Был убран параметр --no-spliced-alignment, тк мы картируем транскриптомыне данные - а при прицессинге мРНК происходит сплайсинг - поэтому мы и выравнивем с инделями, зная, что сплайсинг есть и будет
samtools view -b 12_chr8_altoref.sam -o 12_chr8_altoref.bam Перевод в бинарный файл
samtools sort 12_chr8_altoref.bam 12_chr8_altoref_sorted Сортировка
samtools index 12_chr8_altoref_sorted.bam индексация
htseq-count -i gene_id -s no -m union -f bam 12_chr8_altoref_sorted.bam /nfs/srv/databases/ngs/Human/rnaseq_reads/gencode.v19.chr_patch_hapl_scaff.annotation.gtf -o 12_c8_union.sam Подсчет чтений.
-i - нужен для задания индекса
-s - специфично ли исследование к считываемой цепочке (или необходимо анализировать оба направления считывания - тогда пишется "no")
-f - формат входного файла - bam/sam
-m - способ подсчета: union; intersection-strict - только если чтение легло на ген целиком; intersection-nonempty - если чтение имеет общую последовательность с геном

Триммирование

Изначально было 17507 чтений.
Результат работы Trimmomatic: 

 Input Reads: 17507 Surviving: 17398 (99,38%) Dropped: 109 (0,62%)
До обрезки
После обрезки
На общем анализе видно, что качество побуквенное, что до, что после обрезки - хорошее. image
Опасения у программы (да и у меня)вызывает GC-контент, который немного нестабилен в зависимости от позиции. Но запуск trimmomatic с параметром LEADING:20 - то есть обрезка по качеству последовательностей еще и с начала - ничего не поменял. То есть качество чтений в самом начале хорошее, отчего непонятно чем объяснить такую картину. image

Анализ выравнивания

Откартировано 98.01% чтений
Вывод программы hisat2: 

17398 reads; of these:
  17398 (100.00%) were unpaired; of these:
    346 (1.99%) aligned 0 times
    17052 (98.01%) aligned exactly 1 time
    0 (0.00%) aligned >1 times
98.01% overall alignment rate
Вывод: Кажется, это очень хорошее качество картирования!

thseq-count

Я сделала запуск с тремя разными параметрами. Файлы выдачи обсчитала командой "sort 12_c8_union.sam | uniq -c"
Выдачи union и nonempty совпали. А вот strict, ожидаемо, оставил больше последовательностей неподсчитанными (примерно на треть).

Таблица 2. Подсчет чтений
-m union 
__no_feature    1243
__ambiguous     0
__too_low_aQual 0
__not_aligned   346
__alignment_not_unique  0
 
    204         XF:Z:ENSG00000104738.12
  15605         XF:Z:ENSG00000253729.3
   1243         XF:Z:__no_feature
    346         XF:Z:__not_aligned
-m intersection-strict 
__no_feature    1676
__ambiguous     0
__too_low_aQual 0
__not_aligned   346
__alignment_not_unique  0
 
    188         XF:Z:ENSG00000104738.12
  15188         XF:Z:ENSG00000253729.3
   1676         XF:Z:__no_feature
    346         XF:Z:__not_aligned
-m intersection-nonempty 

__no_feature    1243
__ambiguous     0
__too_low_aQual 0
__not_aligned   346
__alignment_not_unique  0

    204         XF:Z:ENSG00000104738.12
  15605         XF:Z:ENSG00000253729.3
   1243         XF:Z:__no_feature
    346         XF:Z:__not_aligned
Основной белок - каталитическая субъединица ДНК-зависимой протеин-киназы. А второй белок - ответственный за инициацию репликации и крайне консервативный. Вполне ожидаемо, что их гены будут на находится столь близко друг к другу.