Программы пакета BLAST для работы с нуклеотидными последовательностями

Задание 1. Поиск в геноме участков, кодирующих белки, похожие на заданный

Имея аминокислотную последовательность белка THIS_BACSU из Bacillus subtilis, мы хотим узнать, закодированы ли похожие белки в геноме другого организма (в нашем случае Geobacillus thermodenitrificans). Для этого воспользуемся программами пакета BLAST.

Вначале создадим индексные файлы пакета BLAST+ для поиска по геному бактерии Geobacillus thermodenitrificans при помощи команды с необходимыми параметрами:

makeblastdb -in gt_genome.fasta -out gt -dbtype nucl

Теперь, чтобы найти гомологи белка THIS_BACSU по геному бактерии Geobacillus thermodenitrificans, воспользуемся программой TBLASTN.
Для этого выполним соответствующую команду с необходимыми параметрами:

tblastn -query this_bacsu.fasta -db gt -out this_gt.txt -evalue 0.001

По результатам поиска, сохранённым в файле this_gt.txt, заполним таблицу:

Число находок с E-value < 0,001	1
E-value лучшей находки	2e-10
Название последовательности с лучшей находкой	CP000557.1 Geobacillus thermodenitrificans NG80-2, complete genome
Координаты лучшей находки	599768 - 599962
Доля последовательности белка THIS_BACSU, вошедшая в выравнивание с лучшей находкой	65/66 ≈ 0.98

Задание 2. Нахождение записи EMBL по последовательности программой BLASTN

Используя сайт EBI, где представлен сервис программы BLASTN, сделаем поиск в разделе EMBL Standard Prokaryote, задав при этом нуклеотидную последовательность.
Для поиска необходимо выполнить несколько шагов:

Step 1 - отмечаем нужную базу данных

↓

Step 2 - загружаем файл с последовательностью

↓

Step 3 - выбираем интересующую программу

↓

Step 4 - выполняем поиск записей

В результате нашлось очень много записей, но лишь 2 из них имеют процент совпадения 100% и E-value = 4.0E-96.
Их идентификаторы - CP003686 и AB000631.
Рассмотрим вторую находку, где длина последовательности не ~2 млн, а лишь 4177.

○ находка соответствует записи AB000631 в банке EMBL
○ координаты заданной нуклеотидной последовательности в записи: 1101 - 1280, причём последовательность соответствует направлению записи
○ в поле FT записи описан только один участок, пересекающийся с заданной нуклеотидной последовательностью:

Координаты всего участка: 741 - 1846
Координаты пересекающегося участка: 741 - 1280
Направление участка - прямое относительно заданной последовательности

Задание 3. Поиск гомологов гена программой BLASTN

1) Прежде чем осуществлять поиск, нужно создать fasta-файл с нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок THIS_BACSU.

Для этого:

1. в записи Swiss-Prot этого белка выберем одну из записей EMBL (например, AL009126), на которые в файле приведены ссылки →
DR EMBL; AL009126; CAB13025.1; -; Genomic_DNA.
2. используя поиск по странице (Ctrl+F), находим CDS, соответствующую нашему белку THIS_BACSU
3. с помощью команды вырежем из файла AL009126.embl участок с координатами 1244844 - 1245044 по прямой цепи:

seqret "embl:AL009126[1244844:1245044]"

В итоге получим файл al009126.fasta.

2) Затем выполним поиск гомологов этого гена в геноме бактерии Geobacillus thermodenitrificans с помощью команды программы blastn:

blastall -p blastn -d gt -i al009126.fasta -o this_gt_blastn.txt

По результатам поиска, сохранённым в файле this_gt_blastn.txt, заполним таблицу, аналогичную таблице из Задания 1:

	BlastN	TblastN
Число находок с E-value < 0,001	1	1
E-value лучшей находки	0.034	2e-10
Название последовательности с лучшей находкой	CP000557.1 Geobacillus thermodenitrificans NG80-2, complete genome	CP000557.1 Geobacillus thermodenitrificans NG80-2, complete genome
Координаты лучшей находки	1888250 - 1888266	599768 - 599962
Доля последовательности белка THIS_BACSU, вошедшая в выравнивание с лучшей находкой	Нельзя подсчитать, так как в полученном файле нет длины последовательности гена, но в любом случае доля будет меньше, чем у TblastN	65/66 ≈ 0.98

3) Наблюдения (различия в поиске при помощи tblastn и blastn):

○ в обоих случаях находка единственная и одинаковая
○ E-value меньше у tblastn, чем у blastn, причём намного => tblastn даёт более точные результаты
○ доля при поиске с помощью tblastn выше, чем у blastn

Выходит, что blastN находит практически идентичные, но очень короткие участки последовательностей. Сходства между более-менее удаленными друг от друга гомологами эта программа не видит. В отличие от TblastN, здесь выравниваются не аминокислотные, а нуклеотидные последовательности, и не учитывается то, что разные триплеты могут кодировать одну и ту же аминокислоту. Кроме того, при выравнивании аминокислотных последовательностей учитывается также сходство аминокислот в случае неидентичности, а здесь выравниваются только одинаковые нуклеотиды.