Учебная страница курса биоинформатики,
год поступления 2014

Семестры Студенты Преподаватели

• 2024
• 2023
• 2022
• 2021
• 2020
• 2019
• 2018
• 2017

• ...

Чтение последовательностей по Сэнгеру

Результат должен быть представлен на сайте до следующего вторника (13 окт), включительно. Запись в очередь обязательна.

Прошу всех выдержать этот срок для данного задания. ААл.

1. По результатам хроматограмм из капиллярного секвенатора по Сэнгеру и последовательности, сгенерированной программой, получить последовательность фрагмента ДНК

Капиллярный секвенатор по Сангеру выдает файлы с хроматограммой и последовательностью в формате .ab1. Приписывание буквы сигналу секвенатора называется по англ. "base calling". Для просмотра и редактирования будем использовать программу Chromas (Lite).

Дано: два файла в формате .ab1, соответствующие прочтению прямой и обратной цепочки анализируемой ДНК. См. список данных, файлы лежат на диске P: в соответствующей директории ...term3/.../pr6/data

Результат должен быть представлен на странице вашего сайта. Он должен включать

1. Ссылки на исходные файлы

2. Ссылку на выравнивание прямой и комплементарной к обратной последовательности с отмеченными измененными нуклеотидами в проекте JalView

3. Ссылку на файл в формате fasta с "чистой" прочтенной последовательностью. "Чистая" - значит, вы проверили каждый нуклеотид и вынесли решение о том, какой он в анализируемой ДНК. В последовательности допускаются вырожденные коды (W = A или T; N = A, T, G или C; и т.п.), если есть веские основания их употреблять.

4. Протокол с описанием проблем при расшифровки последовательности и обоснованием ваших решений этих проблем. Обязательно включение не менее четырех фрагментов хроматограмм, иллюстрирующих проблемы, и одного - в котором все очевидно (итого - пять рис.). Каждый фрагмент, представленный и на прямой, и на обратной цепочке, должен быть проиллюстрирован рисунком с двумя хроматограммами - прямой и комплементарной к обратной цепочке (reverse complement). Эти хроматограммы должны быть выровнены в окрестности анализируемого нуклеотида или участка; на рис. должно быть достаточное для оценки ситуации число соседних сигналов.

Уточнение. Нуклеотиды, измененные вами (замена, вставка, делеция) по сравнению с последовательностью в исходных файлах, должны быть указаны одним из способов:
 * маленькими буквами в выравнивании прямой и обратной последовательности
 * любым другим способом в `JalView`, например, вставкой новой строки разметки под выравниванием
 * перечислением позиций выравнивания в отчёте

Примерный порядок действий.

• откройте файл с прямой последовательностью
• вызовите еще раз Chromos, откройте файл с обратной последовательностью и перейдите к комплементарной цепочке
• настройте масштабы по вертикали и горизонтали; по горизонтали - одинаковый масштаб для двух окошек

• выровняйте две хроматограммы с использованием поиска подслов (find); повторять эту процедуру придется несколько раз - для каждого проблематичного нуклеотида или участка, т.к. выравнивание сбивается(увы, бесплатная версия не хочет выравнивать хроматограммы )

• определите и запишите в протоколе границы не читаемых 5'- и 3'-участков в каждой последовательности; координаты определяйте по прямой последовательности;
• удалите не читаемые 5'- и 3'- концы; для этого включите опцию Continuous edit

• охарактеризуйте на глаз качество каждой хроматограммы:

  • во сколько раз в среднем сигнал превосходит шум; (линеечка позволяет определять координаты точки по X и Y)
  • равномерна ли средняя сила сигнала и шума вдоль оси X;
  • во сколько раз различается сила у разных очевидных сигналов, зависит ли она от нуклеотида;
  • какие еще особенности хроматограммы в целом вы заметили;
• просмотрите всю прямую последовательность и отредактируйте ее
  • типичные сложные места:
    • шум выше среднего уровня шума и почти как сигнал;
    • пик на нетипичном расстоянии от соседей - вклинился лишний или, наоборот, соседние пики нетипично удалены
    • вместо двух или более пиков - один широкий
  • проверяйте сложные места по второй цепочке (если она имеется в данном месте)
• редактирование может состоять в
  • замене буквы
  • удалении лишней буквы
  • вставке буквы между предложенными софтом секвенатора
• все исправления должны быть маленькими буквами!
• сделайте то же со второй последовательностью

• сохраните обе последовательности в формате fasta и выровняйте их в JalView

Предостережения.

• Помните, что после "reverse comlement" конец прочтения окажется в начале перевернутой хроматограммы. Это существенно для понимания размера начальных некачественных участков.

• Все выравниватели в JalView маленькие буквы превращают в большие. Чтобы сохранить маленькие буквы выровняйте последовательности в JalView вручную (Shift + мышка или Ctrl + мышка позволяют двигать посл-ть). Готовясь, я поступал так: выравнивал программой, потом исхоные последовательности выравнивал вручную, глядя на выравнивание.

• На забудьте, что в JalView должна быть установлена раскраска по нуклеотидам!

2. Приведите пример не читаемой хроматограммы

• Результат - картинка на сайте и подпись с объяснением.

  Файлы см. в директории bad там же на диске P: