Учебная страница курса биоинформатики,
год поступления 2016

Семестры Студенты Преподаватели

• 2024
• 2023
• 2022
• 2021
• 2020
• 2019
• 2018
• 2017

• ...

Практикум 6. Чтение последовательностей по Сэнгеру

1. Прочитать последовательность ДНК на основании данных, полученных из капиллярного секвенатора по Сэнгеру. Составить отчёт о проблемах при чтении хроматограмм

Пояснения.

Капиллярный секвенатор выдает файлы с хроматограммой и автоматически прочтённой последовательностью в формате .ab1.

Вам дано два файла в формате .ab1, соответствующие прочтению прямой и обратной цепочки секвенируемой ДНК. См. список данных, файлы лежат на диске P в соответствующей директории: P:\y16\term3\block2\ab1_files

Для просмотра хроматограмм и редактирования автоматического прочтения будем использовать программу Chromas (Lite).

Отчет должен быть представлен на странице вашего сайта.

Термины

Проблемный нуклеотид — тот, по которому вы приняли решение, отличное от предложенного программой, или вы согласились с программой, но необходимо было проанализировать хроматограммы и принять решение.

Проблемные нуклеотиды в последовательности выделяйте строчными буквами.

Полиморфизм — нуклеотид, про который вы решили, что в секвенируемой ДНК встречаются два (или более) варианта.

Полиморфизмы обозначайте кодами вырожденных нуклеотидов (ambiguity codes), см. https://droog.gs.washington.edu/parc/images/iupac.html.

Что должно быть в отчёте.

• Ссылка на файл с результатом — последовательностью в fasta формате с выделенными строчными буквами проблемными нуклеотидами и полиморфизмами.

• JalView-проект с выравниванием прямого и обратного прочтений (тех частей, которые вы признали пригодными); выделите проблемные нуклеотиды и полиморфизмы.

• Обоснование ваших решений для четырех-пяти проблемных нуклеотидов или полиморфизмов:

  • картинка с выровненными хроматограммами окрестности проблемного нуклеотида, достаточной для оценки ситуации (по три – четыре с каждой стороны);

  • ваше решение и обоснование.
• Характеристику хроматограммы в целом:
  • длины начального и конечного нечитаемых участков для прямого и обратного прочтений;
  • оценку (на глаз) отношения сигнала и шума в среднем;
  • неравномерность силы сигнала и шума вдоль последовательности;
  • другие особенности.
• Ссылки на исходные файлы в .ab1 формате (для удобства проверяющего).

Примерный порядок действий.

• откройте файл с прямой последовательностью;
• вызовите еще раз Chromas, откройте файл с обратной последовательностью и перейдите к комплементарной цепочке;

• настройте масштабы по вертикали и горизонтали; по горизонтали — одинаковый масштаб для двух окошек;

• найдите соответствующие участки двух хроматограмм; разумно использовать поиск подслов (find); повторять эту процедуру придется несколько раз, для каждого проблематичного нуклеотида или участка, т.к. выравнивание сбивается (увы, бесплатная версия не хочет выравнивать хроматограммы:( )
• определите и запишите в протоколе границы нечитаемых 5'- и 3'-участков в каждой последовательности; координаты определяйте по прямой последовательности;
• удалите нечитаемые 5'- и 3'- концы; для этого включите опцию Continuous edit;

• охарактеризуйте на глаз качество каждой хроматограммы;

• просмотрите всю прямую последовательность и отредактируйте ее:
  • типичные сложные места:
    • шум выше среднего уровня шума и почти как сигнал;
    • пик на нетипичном расстоянии от соседей: вклинился лишний или, наоборот, соседние пики нетипично удалены;

    • вместо двух или более пиков — один широкий

  • проверяйте сложные места по второй цепочке (если она имеется в данном месте);
• редактирование может состоять в:
  • замене буквы;
  • удалении лишней буквы;
  • вставке буквы между предложенными софтом секвенатора;
• все исправления должны быть маленькими буквами!
• сделайте то же со второй последовательностью;
• сохраните обе последовательности в формате fasta;

• выровняйте последовательности программой needle; выравнивание получите в формате fasta (читайте needle -help -verbose);

• импортируйте в JalView.

Предостережения.

• Помните, что после "reverse complement" конец прочтения окажется в начале перевернутой хроматограммы. Это существенно для понимания размера начальных некачественных участков.

• Все выравниватели в JalView маленькие буквы превращают в большие, поэтому рекомендуется выравнивать needle'ом, а уже потом импортировать в JalView.

• На забудьте, что в JalView должна быть установлена раскраска по нуклеотидам!

2. Приведите пример нечитаемого фрагмента хроматограммы

Фрагмент можно взять из любого файла. Совсем плохие хроматограммы см. в директории bad там же на диске P.

Постарайтесь выбрать фрагмент, про который можно что-то написать.

В отчете — картинка и объяснение.