На главную страницу четвертого семестра pal2nal

Оценка давления отбора на ген белка AMPA_ECOLI

Цель этого упражнения состоит в том, чтобы определить характер давления отбора на ген белка AMPA_ECOLI с момента расхождения кишечной палочк и синегнойной палочки.
Файл с аминокислотной последовательностью был подан на вход программе blastp с целью найти ортолога в синегнойной палочке (Pseudomonas aeruginosa). Был найден белок AMPA_PSEA7, и, поскольку первая часть ID совпадает с ID исходного белка, было предположено, что они выполняют одну функцию. Однако, выравнивание исходной последовательности с предполагаемым ортологом имеет Identity всего лишь 55% :

Score =  551 bits (1419),  Expect = 3e-157, Method: Compositional matrix adjust.
 Identities = 275/498 (55%), Positives = 363/498 (72%), Gaps = 5/498 (1%)

Query  1    MEFSVKSGSPEKQRSACIVVGVFEPRRLSPIAEQLDKISDGYISALLRRGELEGKPGQTL  60
            MEF VKS  PE  ++A +V+ V E R+L   A+ +D  + G I A+L+RG+L GK GQTL
Sbjct  1    MEFLVKSVRPETLKTATLVLAVGEGRKLGASAKAVDDATGGAIGAVLKRGDLAGKVGQTL  60

Query  61   LLHHVPNVLSERILLIGCGKERELDERQYKQVIQKTINTLNDTGSMEAVCFLTELHVKGR  120
            LL ++PN+ +ER+LL+G GKEREL +RQY+++    ++TL      +AV  L +L VKGR
Sbjct  61   LLQNLPNLKAERVLLVGAGKERELGDRQYRKLASAVLSTLKGLAGADAVLALGDLAVKGR  120

Query  121  NNYWKVRQAVETAKETLYSFDQLKTNKSEPRRPLRKMVFNVPTRRELTSGERAIQHGLAI  180
            + + K R  VET  + LY FD+ K+ K+EP +   K +  +  + +  + E+  +   AI
Sbjct  121  DAHAKARLLVETLADGLYVFDRYKSQKAEPLK--LKKLTLLADKADSAAVEQGSKEAQAI  178

Query  181  AAGIKAAKDLGNMPPNICNAAYLASQARQLADSYSKNVITRVIGEQQMKELGMHSYLAVG  240
            A G+   +DLGN+PPN+C+  +L  QA+ LA  + K +   V  EQ+++ELGM S+LAV 
Sbjct  179  ANGMALTRDLGNLPPNVCHPTFLGEQAKALAKEF-KGLKVEVHDEQKLRELGMGSFLAVA  237

Query  241  QGSQNESLMSVIEYKGNASEDARPIVLVGKGLTFDSGGISIKPSEGMDEMKYDMCGAAAV  300
            QGS+    + V++Y G A +D  P VLVGKG+TFD+GGIS+KP  GMDEMK+DMCGAA+V
Sbjct  238  QGSEQPPRLIVLQYNG-AKKDQAPHVLVGKGITFDTGGISLKPGLGMDEMKFDMCGAASV  296

Query  301  YGVMRMVAELQLPINVIGVLAGCENMPGGRAYRPGDVLTTMSGQTVEVLNTDAEGRLVLC  360
            +G  R V ELQLPIN++G+LA  ENMP G A RPGD++TTMSGQTVE+LNTDAEGRLVLC
Sbjct  297  FGTFRAVLELQLPINLVGLLACAENMPSGGATRPGDIVTTMSGQTVEILNTDAEGRLVLC  356

Query  361  DVLTYVERFEPEAVIDVATLTGACVIALGHHITGLMANHNPLAHELIAASEQSGDRAWRL  420
            D LTY ERF+P++V+D+ATLTGAC++ALG + +GLM N+  L  +L+ A E + DRAW+L
Sbjct  357  DALTYAERFKPQSVVDIATLTGACIVALGSNTSGLMGNNEALVRQLLKAGEFADDRAWQL  416

Query  421  PLGDEYQEQLESNFADMANIGGRPGGAITAGCFLSRFTRKYNWAHLDIAGTAWRS-GKAK  479
            PL DEYQEQL+S FAD+ANIGG   G ITAGCFLSRF +KY+WAHLDIAGTAW S GK K
Sbjct  417  PLFDEYQEQLDSPFADIANIGGPKAGTITAGCFLSRFAKKYHWAHLDIAGTAWISGGKDK  476

Query  480  GATGRPVALLAQFLLNRA  497
            GATGRPV LL Q+LL RA
Sbjct  477  GATGRPVPLLTQYLLERA  494

При поиске этих белков в Uniprot (AMPA_PSEA7 и AMPA_ECOLI), выдаётся информация о их функциях: и тот и другой белок является лейциновой аминопептидазой, необходимой для процессинга внутриклеточных белков, а также катализирующей удаление незамещенных N-концевых аминокислот. Поскольку ортологами являются белки, схожие по функции, но находящиеся в разных организмах, то наверное можно пренебречь столь малым значением Identity и испольовать данные белки для дальнейших действий.
Для получения нуклеотидной последовательности гена белка AMPA_PSEA7 была использована программа tblastn, где на вход подавалась ранее полученная аминокислотная последовательность этого белка.
С целью попарного сравнения нуклеотидных и аминокислотных последовательностей данных белков, было проведенно глобальное выравнивание с помощью программы needle. При поверхностном рассмотрении, можно заметить, что выравнивания не совпадают. Это объясняется тем, что выравниваются не кодоны, а отдельные нуклеотиды, и открывается большое количество гэпов.

Работа с PAL2NAL

Теперь, имея некоторые сведения о данных белках, воспользуемся специальной программой PAL2NAL для конвертирования множественных выравниваний белков и соответствующих им нуклеотидных последовательностей в выравнивание кодонов. Ее возможности:

Программа выполняет свою функцию, даже если поданная на вход ДНК не полностью соответсвует введенной последовательности белка.

Она также справляется со сдвигами рамки, что помогает анализировать псевдогены.

Полученное выравнивание кодонов может быть в последствие использована для подсчета синонимических (Ks) и несинонимических (Ka) замен.

Воспользовавшись этой программой (запросив формат файла с результатами как "Кодон с аминокислотой"), получила следующие выравневание. В начале можно увидеть 9 предупреждений о несоответствии аминокислот кодонам.
Непосредственно для оценки давления естественного отбора используется подсчет Ka/Ks. Это отношение несинонимичных замен нуклеотидов к синонимичным. Для подсчета Ka/Ks, были использованы опции Remove gaps, inframe stop codons :Calculate KS and KA, а также Remove mismatches, т.к. в предыдущий раз PAL2NAL выдал сообщение о несовпадениях, в качестве формата выхада указала FASTA. Кроме того, прищлось отредактировать аминокислотное выравнивание, т.к. эта программа оказалась весьма требовательна к формату.
В итоге, были получены следующие значения:PAL2NALoutput.txt. Поскольку значение Ka/Ks оказалось намного меньше единицы, то можно предположить, что отбор, влиявший на эти белки, был стабилизирующим.