Выравнивание последовательностей

1. Программа подсчёта инделей

Программа indels.py разработана для анализа файлов выравнивания, полученных с помощью алгоритмов Нидлмана-Вунша (глобальное) и Смита-Ватермана (локальное). Программа принимает имя файла в качестве аргумента командной строки и выводит количество инделей (групп подряд идущих гэпов) для каждой из двух последовательностей, а также их сумму.

Программа

2. Глобальное парное выравнивание гомологичных белков

Для анализа были выбраны три пары гомологичных белков из Escherichia coli (штамм K12) и Bacillus subtilis (штамм 168), имеющих одинаковые мнемоники функции в Swiss-Prot. Выравнивание выполнялось с помощью программы NCBI Needleman-Wunsch Global Align (Protein), являющаяся реализацией алгоритма Нидлмана-Вунша, с параметрами по умолчанию (матрица BLOSUM62, штраф за открытие гэпа = 10, штраф за продолжение гэпа = 0.5).

Protein Name	ID 1	ID 2	Score	% Identity	% Similarity	Gaps	Indels
6-phosphogluconate dehydrogenase, decarboxylating	6PGD_ECOLI	6PGD_BACSU	1712	70.0%	83.4%	3	3
Acetate kinase	ACKA_ECOLI	ACKA_BACSU	796	43.3%	63.0%	13	9
Acylphosphatase	ACYP_ECOLI	ACYP_BACSU	122	39.0%	54.5%	5	3

3. Локальное парное выравнивание гомологичных белков

Для тех же трёх пар белков было выполнено локальное выравнивание с помощью программы NCBI Protein BLAST (BLASTP) с опцией "Align two or more sequences" с параметрами по умолчанию.

Protein Name	ID 1	ID 2	Score	% Identity	% Similarity	Gaps	Indels	Coverage ECOLI	Coverage BACSU
6-phosphogluconate dehydrogenase, decarboxylating	6PGD_ECOLI	6PGD_BACSU	1783	70.0%	83.4%	3	3	99.8%	99.8%
Acetate kinase	ACKA_ECOLI	ACKA_BACSU	816	43.3%	64.0%	11	8	99.3%	98.7%
Acylphosphatase	ACYP_ECOLI	ACYP_BACSU	150	43.0%	60.5%	0	0	81.5%	81.3%

4. Комментарии к выравниваниям

4.1. 6-фосфоглюконатдегидрогеназа (6PGD_ECOLI х 6PGD_BACSU)

Белки являются высоко гомологичными по всей длине. Глобальное выравнивание показывает 70.0% идентичности и 83.4% сходства при минимальном числе гэпов (всего 3) и инделей (3). Это свидетельствует о высокой консервативности 6-фосфоглюконатдегидрогеназы в процессе эволюции и отсутствии крупных вставок или делеций.
Локальное выравнивание даёт практически идентичные результаты: Score = 1783, покрытие составляет 99.8% для обоих белков, что подтверждает гомологию на всём протяжении последовательностей. В данном случае локальное выравнивание не является более информативным, чем глобальное, так как алгоритм Смита-Ватермана не выявил участков, которые следовало бы исключить из выравнивания. Белки гомологичны по всей длине, и оба метода дают адекватное представление об их сходстве.

4.2. Ацетаткиназа (ACKA_ECOLI x ACKA_BACSU)

Белки являются гомологичными, однако степень сходства ниже, чем у 6PGD: 43.3% идентичности и 63.0% сходства в глобальном выравнивании. Количество гэпов (13) и инделей (9) также выше, что указывает на присутствие нескольких участков с вставками/делециями, накопившимися в ходе эволюции этих белков у E. coli и B. subtilis.
Локальное выравнивание показывает покрытие 99.3% и 98.7% для белков E. coli и B. subtilis соответственно. Это говорит о том, что, несмотря на наличие вариабельных участков, белки гомологичны практически по всей длине, и алгоритм Смита-Ватермана не стал исключать значительные фрагменты. Локальное выравнивание в данном случае несколько более информативно, так как позволяет увидеть, что даже при наличии делеций и вставок консервативное ядро белка сохраняется, а покрытие остаётся высоким. Различия между глобальным и локальным выравниваниями незначительны, что подтверждает общее эволюционное происхождение этих белков.

4.3. Ацилфосфатаза (ACYP_ECOLI x ACYP_BACSU)

Белки демонстрируют умеренную степень сходства: 39.0% идентичности и 54.5% сходства в глобальном выравнивании. Это самый низкий показатель среди трёх рассмотренных пар. Однако наличие сходства выше случайного и присутствие консервативных остатков, характерных для ацилфосфатаз, подтверждает гомологию этих белков.
Локальное выравнивание показывает значительно меньшее покрытие: 81.5% для белка E. coli и 81.3% для белка B. subtilis. При этом в локальном выравнивании отсутствуют гэпы и индели (0), что говорит о том, что алгоритм Смита-Ватермана выделил наиболее консервативный участок (ядро белка), который выровнялся без делеций и вставок, и отбросил менее консервативные концевые фрагменты.

В данном конкретном случае локальное выравнивание значительно более информативно, чем глобальное. Оно чётко показывает, что:

Белки содержат гомологичный домен (вероятно, каталитический), который хорошо выравнивается.
Остальные участки (примерно 19% длины каждого белка) недостаточно консервативны, чтобы быть включёнными в оптимальное локальное выравнивание.
Те пары остатков, которые были сопоставлены в глобальном выравнивании за пределами консервативного ядра, скорее всего, не являются истинно гомологичными, а были "натянуты" алгоритмом Нидлмана-Вунша в силу его стремления выровнять всю длину последовательностей. Локальное выравнивание в этом случае даёт биологически более осмысленную картину.

5. Результат применения программ выравнивания к неродственным белкам

Для анализа были выбраны два белка Escherichia coli (штамм K12) с разными мнемониками функций: ENO_ECOLI (енолаза, 432 а.о.) и G6PI_ECOLI (глюкозо-6-фосфат изомераза, 549 а.о.). Оба белка являются ферментами гликолиза, но катализируют разные реакции и принадлежат к разным эволюционным семействам, то есть не являются гомологами.

5.1. Глобальное выравнивание (NCBI Needleman-Wunsch Global Align)

Глобальное выравнивание было выполнено, несмотря на отсутствие гомологии. Результат представлен в таблице ниже. Алгоритм Нидлмана-Вунша в силу своей природы пытается выровнять последовательности по всей длине, что приводит к артефициальному результату.

Protein Name	ID 1	ID 2	Score	% Identity	% Similarity	Gaps	Indels
Enolase x G6P isomerase	ENO_ECOLI	G6PI_ECOLI	-157	16.8%	29.1%	159	25

Примечание: Отрицательный Score (-157), крайне низкий процент идентичности (16.8%) и огромное количество гэпов (159 из 570 позиций, то есть 27%) свидетельствуют о том, что белки не являются гомологами. Глобальное выравнивание в данном случае биологически бессмысленно.

5.2. Локальное выравнивание (NCBI BLASTP, Align Two Sequences)

При попытке выполнить локальное выравнивание с помощью NCBI Protein BLAST (BLASTP) с опцией "Align two or more sequences" был получен результат: "No significant similarity found" (значимого сходства не обнаружено).
Это означает, что алгоритм Смита-Ватермана не смог найти ни одного участка локального сходства, который прошёл бы порог значимости. Данный результат является прямым подтверждением отсутствия гомологии между выбранными белками.

Protein Name	ID 1	ID 2	Score	% Identity	% Similarity	Gaps	Indels	Coverage 1	Coverage 2
Enolase x G6P isomerase	ENO_ECOLI	G6PI_ECOLI	No significant similarity found

5.3. Комментарии

Сравнение результатов глобального и локального выравнивания.

Енолаза (ENO_ECOLI) и глюкозо-6-фосфат изомераза (G6PI_ECOLI) — это два фермента гликолиза, катализирующие разные реакции. Сравнение их аминокислотных последовательностей с помощью методов биоинформатики полностью подтверждает отсутствие эволюционного родства (гомологии) между ними.

Глобальное выравнивание (алгоритм Нидлмана-Вунша) дало крайне низкие и даже отрицательные показатели: Score = -157, процент идентичности = 16.8%, процент сходства = 29.1%. Отрицательный вес выравнивания означает, что количество несовпадений и гэпов настолько велико, что даже алгоритм, обязанный выровнять последовательности целиком, "штрафуется" больше, чем "вознаграждается" за случайные совпадения. Значение идентичности (16.8%) лишь немногим выше случайного (5% для 20 аминокислот), что указывает на отсутствие даже отдалённого родства. Огромное количество гэпов (159 из 570 позиций, 27%) и инделей (25) говорит о том, что алгоритм был вынужден вставить множество делеций, пытаясь "растянуть" последовательности для выравнивания. Такой результат биологически бессмыслен и является ярким примером того, почему глобальное выравнивание категорически неприменимо к неродственным белкам.
Локальное выравнивание (алгоритм Смита-Ватермана, реализованный в BLASTP) не обнаружило значимого сходства ("No significant similarity found"). Это означает, что даже короткие участки, которые могли бы случайно совпасть, не прошли порог значимости (E-value). В отличие от глобального, локальное выравнивание "отказывается" выравнивать последовательности, не имеющие достоверного сходства, что защищает исследователя от ложных выводов о гомологии.

5.4. Выводы:

Белки ENO_ECOLI и G6PI_ECOLI не являются гомологами, что надёжно подтверждается обоими методами.
Глобальное выравнивание для неродственных белков создаёт артефакты (отрицательный Score, 27% гэпов, 25 инделей) и не должно использоваться для оценки гомологии.
Локальное выравнивание корректно сообщает об отсутствии значимого сходства.
Данный пример наглядно демонстрирует, почему для поиска гомологов всегда используется локальное выравнивание (BLAST), а глобальное (needle) — только для заранее известных гомологов.

6. Множественное выравнивание белков и импорт в Jalview

6.1. Выбор белков

Для множественного выравнивания была выбрана мнемоника 6PGD. Рекомендованное полное имя белка из ECOLI: 6-phosphogluconate dehydrogenase, decarboxylating (6-фосфоглюконатдегидрогеназа, декарбоксилирующая).

По запросу 6PGD с фильтром «Reviewed» (Swiss-Prot) в UniProt было найдено 1223 белка. Для множественного выравнивания, помимо обязательных 6PGD_ECOLI и 6PGD_BACSU, были выбраны пять белков из разных таксономических групп, чтобы охватить широкий спектр эволюционного разнообразия:

6PGD_HUMAN — Homo sapiens (человек, млекопитающие, Eukaryota)
6PGD1_YEAST — Saccharomyces cerevisiae (пекарские дрожжи, грибы, Eukaryota)
6PGD1_ARATH — Arabidopsis thaliana (резуховидка Таля, растения, Eukaryota)
6PGD_SALTY — Salmonella typhimurium (сальмонелла, гамма-протеобактерии, Bacteria)
6PGD_SYNY3 — Synechocystis sp. PCC 6803 (цианобактерии, Bacteria)

Таким образом, в выравнивании участвуют 7 последовательностей, представляющих три домена жизни: бактерии (4 белка: 6PGD_ECOLI, 6PGD_BACSU, 6PGD_SALTY, 6PGD_SYNY3) и эукариоты (3 белка: 6PGD_HUMAN, 6PGD1_YEAST, 6PGD1_ARATH — животные, грибы, растения).

6.2. Метод выравнивания

Множественное выравнивание было выполнено с помощью программы MUSCLE (MUltiple Sequence Comparison by Log-Expectation) на сервере EMBL-EBI с параметрами по умолчанию. Последовательности были загружены с UniProt вформате FASTA (canonical) и объединены в один файл. Результат выравнивания был сохранён в формате ClustalW (.aln). MUSCLE является одним из наиболее точных и широко используемых алгоритмов множественного выравнивания, основанным на методе log-expectation.

6.3. Проект Jalview

Файл проекта Jalview: 6PGD_alignment.jvp

6.4. Комментарии к выравниванию

Качество выравнивания.
Все семь последовательностей хорошо выровнялись по всей длине, что подтверждает высокую степень консервативности 6-фосфоглюконатдегидрогеназы в эволюции. Основная длина белков составляет 468–490 аминокислотных остатков. Отличия в длине связаны с двумя особенностями:

наличием N-концевого удлинения у цианобактерии Synechocystis sp. (6PGD_SYNY3, остатки 1–13: MQFNVAIMTKRTR), которое отсутствует у всех остальных организмов.
небольшими C-концевыми удлинениями у эукариотических белков человека (6PGD_HUMAN, 5 остатков SSYNA после позиции 483) и пекарских дрожжей (6PGD1_YEAST, 5 остатков STYQA после позиции 489). У растительного белка 6PGD1_ARATH и бактериальных белков C-концевые удлинения отсутствуют.

Гомология.
Все выбранные белки являются гомологами, то есть произошли от общего предкового белка. Они катализируют одну и ту же реакцию в пентозофосфатном пути: окислительное декарбоксилирование 6-фосфоглюконата до рибулозо-5-фосфата с одновременным восстановлением NADP⁺ до NADPH. Широкое распространение 6PGD (1223 аннотированных белка в Swiss-Prot) свидетельствует о фундаментальной роли этого фермента в метаболизме.

Консервативные и вариабельные участки.
При раскрашивании по проценту идентичности в Jalview выравнивание демонстрирует чётко выраженную структуру. Консервативные участки (тёмно-синий цвет) образуют несколько пространственных кластеров, соответствующих функционально важным элементам белка. Ниже приведены номера столбцов выравнивания (по линейке Jalview):

N-концевой участок связывания кофактора NADP⁺ (столбцы 8–56): наиболее плотный консервативный кластер в начале выравнивания, содержащий глицин-богатую петлю (мотив GXGXXG, столбцы 19–28), которая формирует крышку нуклеотид-связывающего кармана. Высокая консервативность остатков глицина в этих позициях критически важна для правильного сворачивания мотива и связывания NADP⁺.
Центральный каталитический домен (столбцы 70–320): наиболее протяжённый консервативный регион, охватывающий практически половину выравнивания. Внутри него выделяются:
- Участок связывания субстрата (столбцы 84–87, 107–112, 136–144, 147–149): остатки, формирующие карман для связывания 6-фосфоглюконата;
- Каталитический центр (столбцы 175–209, особенно 189–192, 194–209): содержит консервативные остатки, непосредственно участвующие в реакции окислительного декарбоксилирования;
- Фосфат-связывающий участок (столбцы 211–256): кластер положительно заряженных и полярных остатков, координирующих фосфатную группу субстрата;
- Ядро каталитического домена (столбцы 260–320): дополнительные консервативные остатки, стабилизирующие трёхмерную укладку активного центра.
Структурный линкерный участок (столбцы 334–398): консервативный регион, соединяющий каталитический и димеризационный домены. Консервативность остатков в столбцах 343–357, 364–398 свидетельствует о важности этой области для правильной ориентации доменов относительно друг друга.
C-концевой димеризационный домен (столбцы 403–474): кластер консервативных остатков на C-конце белка, ответственный за формирование димерной четвертичной структуры. Димеризация необходима для каталитической активности фермента. Наиболее консервативны столбцы 407–409, 414, 422, 426, 432, 436–437, 440, 442, 450, 452–453, 457–461, 463–474.
Вариабельные участки (светлый/белый цвет):
- Столбцы 1–13 (N-конец): вариабельны из-за наличия N-концевого удлинения исключительно у 6PGD_SYNY3.
- Столбцы 475–495 (C-конец): вариабельны из-за наличия C-концевых удлинений у 6PGD_HUMAN и 6PGD1_YEAST, а также делеций у бактериальных белков.
- Поверхностные петли между консервативными блоками также демонстрируют пониженную консервативность, что характерно для участков, не вовлечённых непосредственно в катализ.

6.5. Вывод:

Проведённый анализ множественного выравнивания 6PGD полностью соответствует общим принципам эволюции белковых семейств. Функционально важные участки — кофактор-связывающие, каталитические, димеризационные — находятся под жёстким эволюционным давлением и остаются высоко консервативными от бактерий до человека. В то же время концевые удлинения (как N-концевое у Synechocystis, так и C-концевые у млекопитающих и грибов) являются эволюционно подвижными элементами, которые, по-видимому, не затрагивают каталитическую функцию фермента. Выравнивание наглядно демонстрирует эти эволюционные закономерности и подтверждает высокую информативность множественного выравнивания для анализа структуры и функции белков.