Классификация ферментов (EC)

Задание №0

Для трех трансмембранных бета-баррелей и трех трансмембранных альфа-спиральных белков определила параметры, перечисленные в Таблице 1. Использовала базу данных OPM. При определении медианы числа остатков в одном трансмембранном участке производила округление до целого по правилам округления.

Таблица 1. Параметры для трансмембранных белков

PDB код Тип (спираль, баррель) Какая мембрана (внутренняя или внешняя, организм, органелла) Толщина гидрофобной части мембраны в ангстремах Медиана числа остатков в одном трансмембранном участке
3m73спираль Бактериальная внутренняя мембрана 29.122
4iarспираль Эукариотическая плазматическая мембрана33.624
1l9bспираль Бактериальная внутренняя мембрана31.624
1a0sбаррельБактериальная внешняя мембрана23.89
1uunбаррельБактериальная внешняя мембрана40.710
2ervбаррельБактериальная внешняя мембрана24.711

Из таблицы видно, что для альфа-спиралей среднее количество трансмембранных остатков равно 23, а для бета-тяжей - около 10 остатков. Скорее всего, цифры будут сильнее различаться при разной толщине мембраны и разном угле наклона трансмембранных участков.

Задание №1: отбор гомологов

Создала репрезентативную выборку гомологов выданного белка 4JR9. Нашла его номер на сайте Uniprot (P10903). Бактерия (Escherichia coli), из которой взят данный белок, относится к филуму Proteobacteria. На сайте NCBI исключила поиск по данному филуму и по эукариотам, выставила порог e-value равный 1 и количество последовательностей, выдаваемых при поиске 1000. В качестве базы для поиска выбрала RefSeq (если в качестве базы данных выбрать Swissprot, то будет получено всего 11 последовательностей, что представляет собой недостаточно репрезентативную выборку). Далее с помощью таксономического дерева выбрала последовательности для выравнивания. Делала я это вручную, так как раз пять бласт выдавал ошибку при открытии страницы с деревом.

Новая репрезентативная выборка

Репрезентативная выборка гомологов
Филум Порядок Вид
Chrysiogenetes Chrysiogenales Desulfurispirillum indicum S5
Firmicutes Bacillales Brevibacillus laterosporus
Actinobacteria Actinomycetales Citricoccus sp. CH26A
Firmicutes Selenomonadales Veillonella parvula
Actinobacteria Actinomycetales Actinoplanes globisporus
Bacteroidetes Cytophagales Belliella baltica DSM 15883
Bacteroidetes Cytophagales Cyclobacteriaceae bacterium AK24
Actinobacteria Actinomycetales Tsukamurella paurometabola
Bacteroidetes Flavobacteriales Flavobacterium succinicans
Deinococcus-Thermus Thermales Thermus oshimai
Proteobacteria Burkholderiales Delftia acidovorans
Firmicutes Clostridiales Clostridium carboxidivorans P7
Chloroflexi Sphaerobacterales Nitrolancea hollandica
Planctomycetes Planctomycetales Zavarzinella formosa DSM 19928
Acidobacteria Acidobacteriales Terriglobus roseus DSM 18391

Задание №2: анализ структуры выданного белка

Использовала базу данных OPM для того, чтобы найти в ней выданный белок. На основании полученных данных заполнила таблицу 2.

PDB ID Организм Тип мембраны TC-код Угол наклона спиралей (бета-тяжей) к нормалиКоличество трансмембранных спиралей (бета-тяжей в бочонке)
4JR9Escherichia coli Внутренняя 2.A.1 8 ± 0°12

Таблица 2. Описание структуры трансмембранного нитрат/нитрит обменного белка NarK (идентификатор PDB 4JR9, цепь A).

Задание №3: анализ множественного выравнивания трансмембранных белков

Построила множественное выравнивание отобранных гомологов с помощью программы Muscle. Загрузила множественное выравнивание в программу JalView. Добавила к выравниванию дополнительную аннотацию положения трансмембранных спиралей. Для этого добавила новую пустую строку аннотации и назвала ее "TM_REAL". Переместила исходный белок, для которого есть структура, в верхнюю строку выравнивания. Прикрепила к нему структуру 4JR9, цепь А. Используя появившуюся связь между последовательностью и структурой, пометила участки выравнивания, отвечающие трансмембранным спиралям в белке со структурой в строке-аннотации буквой "М". Добавила к выравниванию предсказание трансмембранных спиралей, выдаваемых программой TMHMM, для гомолога YP_004113709.1 [Desulfurispirillum indicum S5]. Взяла последовательность гомолога и получила для него результат предсказания TMHMM. Создала новую строку аннотации и назвала ее "TM_PREDICTED", после чего нанесла вручную участки, предсказанные TMHMM, в эту строку. Выбрала цветовую схему, позволяющую визуально различать гидрофобные и гидрофильные остатки. Затем установила галочку на "By Conservation" (теперь интенсивность цвета зависит от того, насколько позиция консервативна). Покрутила белок так, чтобы его часть, ориентированная в n-сторону мембраны оказалась сверху, а ориентированная в p-сторону - снизу. Сохранила полученное изображение структуры белка (рисунок 1) и изображение выравнивания (рисунок 2). Предсказание программы TMHMM представлены на рисунке 3.

Рисунок 1.Нитрат/нитрит обменный белок NarK. Цепь А окрашена в цвета выравнивания - более гидрофобные участки - синим, более гидрофильные - красным.

Рисунок 2.Выравнивание репрезентативной выборки. Цветовая схема по гидрофобности, порог консервативности 24%.

Рисунок 3.Предсказание программы TMHMM для белка NarK, цепь А.

По результатам предсказания можно сделать вывод, что программа работает хорошо, так так, во-первых, количество трансмембранных спиралей совпадает, во-вторых, предсказанные и реальные перекрываются довольно сильно, примерно на 70-95%.

Для новой выборки сделала выравнивание (рисунки 4 и 5). На рисунке 5 заряженными аминокислотами считались аспарагиновая и глутаминовая кислота (отрицательно) и гистидин, лизин и аргинин (положительно).

Рисунок 4.Выравнивание репрезентативной выборки. Цветовая схема по гидрофобности, порог консервативности 30%.

Рисунок 5.Выравнивание репрезентативной выборки. Цветовая схема по заряду аминокислот при нейтральном pH, отрицательно заряженные - синие, положительно - красные.

Исходя из полученных данных видно, что заряженные аминокислоты находятся вне мембраны. Правило "positive inside" с помощью данного белка подтвердить нельзя - заряженных аминокислот очень мало.





 

 

© Дудина Дарья.