Программы пакета BLAST для работы с нуклеотидными последовательностями

Создание индексных файлов для работы с локальными версиями программ семейства BLAST

В файлах pm_genome.fasta — полный геном бактерии Pasteurella multocida; vc_genome.fasta включает последовательности из EMBL, составляющие полный геном холерного вибриона (Vibrio cholerae); pa_genome.fasta — полный геном синегнойной палочки (Pseudomonas aeruginosa). На их основе созданы индексные файлы к каждому из геномов поотдельности (так выглядят команды, выполняемые на kodomo-count):

formatdb -i vc_genome.fasta -p F -n vc

formatdb -i pa_genome.fasta -p F -n pa

formatdb -i pm_genome.fasta -p F -n pm

и индексный файл для поиска по всем трем геномам сразу: для удобства сначала создаются текстовые переменные, а затем уже запускается formatdb:

genpath=/home/export/samba/public/tmp

genomes="$genpath/vc_genome.fasta $genpath/pa_genome.fasta $genpath/pm_genome.fasta"

formatdb -i "$genomes" -n 3g -p F

Программа formatdb создает в текущей директории три файла с расширениями nhr, nin и nsq (т.е. на данный момент получено 12 файлов).

Поиск в неаннотированном геноме генов, кодирующих белки, похожие на заданный; поиск сразу по трем генам

Итак, известна аминокислотная последовательность белка ASPG2_ECOLI. Задача — определить, не закодированы ли похожие белки в неаннотированном геноме другого организма. Для этих целей выбирается программа TBLASTN пакета BLAST. Используемая команда (** - vc, pa, pm либо 3g):

blastall -p tblastn -d ** -i aspg2_ecoli.fasta -o **_asp_t.txt

Результаты заношу в таблицу:

Поиск по трем геномам отдельно
Поиск гомологов ASPG2_ECOLI		Геном Vibrio cholerae	Геном Pseudomonas aeruginosa	Геном Pasteurella multocida
Характеристика лучшей находки:
	E-value находки	3*10-16	6*10-74	4.9
	координаты выравнивания(-ий) в записи генома	5399 - 6208	4436 - 3507	4475 - 4392
AC соответствующей записи EMBL		AE004274; AE003852	AE004563 (был заменен 12 июля на AE004091)	AE006188; AE004439
	Координаты CDS в записи EMBL (если они есть)	5222 - 6235	3169 - 4278; 4275 - 6695	3399 - 4928 (комплемент.)
	AC UniProt в записи EMBL (если есть)	Q9KQK3	-	Q9CKU1
Число находок с Е-value<0,01		1	2	0
Поиск по всем трем геномам одновременно
Е-value лучшей находки		9*10-16	1*10-73	-
Число находок с Е-value<0,01		3

Результаты поиска TBLASTN:

• по геному Vibrio cholerae
• по геному Pseudomonas aeruginosa
• по геному Pasteurella multocida
• по 3м геномам
АС в UniProt; координаты CDS в записи EMBL идентифицированы в файлах AE004274.entret и AE006188.entret для геномов Vibrio cholerae и Pasteurella multocida соответственно [пример команды:

entret embl:AE004274 -auto

]. Получить запись EMBL через командную строку мне не удалось, поэтому я прибегла к системе поиска SRS (http://srs.ebi.ac.uk/). Итак, в случае поиска по отдельным индексным файлам, получены следующие результаты: по малому значению E-value локальных выравниваний и фактическому совпадению координат выравнивания/координат CDS в геноме логично предположить, что похожий на исследуемый Белок (ASPG2_ECOLI) закодирован в геноме другого организма (например, Vibrio cholerae: запись

product L-asparaginase I

файла подтверждает мое предположение; в случае с Pseudomonas aeruginosa меня сразу смущает "расхождение направлений" координат выравнивания/координат CDS); в геноме Pasteurella multocida белок, похожий на ASPG2_ECOLI, очевидно, не закодирован.

В случае поиска по трем геномам одновременно, не изменилось число находок с Е-value<0,01; незначительно изменились и сами значения Е-value лучших находок. Это согласуется с тем, что при уменьшении объема выборки происходит уменьшение E-value, следовательно, достоверность находки увеличивается (подтверждение вышесказанного).

Поиск гомологов с помощью программы BLASTN

Проведен поиск гомологов гена m34234 в трёх геномах программой BLASTN. Соответствующая команда:

blastall -p blastn -d 3g -i m34234.fasta -o 3g_m34234_bln.txt

Выбрано по 1 лучшей находке для каждого из геномов (значения E-value выделены жирным шрифтом/подчеркиванием в правом столбце):

AC соответствующей записи EMBL: AE004286, AE003852

Vibrio cholerae	>embl|AE004286|AE004286 Vibrio cholerae O1 biovar eltor str. N16961 chromosome I, section 194 of 251 of the complete chromosome. Length = 10185 Score = 34.2 bits (17), Expect = 0.66 Identities = 17/17 (100%) Strand = Plus / Plus Query: 57 agcattggcattaccca 73 ||||||||||||||||| Sbjct: 7749 agcattggcattaccca 7765	Аннотация соответствующего фрагмента генома: AC соответствующей записи EMBL: AE004286, AE003852 Координаты CDS в записи EMBL: 7407 - 8462 (комплемент.) AC UniProt в записи EMBL: O30663 данная находка случайная, указан абсолютно другой продукт гена (белок sensory box sensor histidine kinase)
Pseudomonas aeruginosa	>embl|AE004563|AE004563 Pseudomonas aeruginosa PAO1, section 124 of 529 of the complete genome. Length = 9937 Score = 50.1 bits (25), Expect = 1e-05 Identities = 49/57 (85%) Strand = Plus / Minus Query: 306 cgacggcttcgtcattacccacggtaccgacacgatggaagaaactgcttacttcct 362 ||||||| |||| || ||||||||||||||||| ||||||| || || |||||||| Sbjct: 4245 cgacggcatcgtgatcacccacggtaccgacaccctggaagagaccgcctacttcct 4189	Аннотация соответствующего фрагмента генома: AC соответствующей записи EMBL: AE004563 (был заменен 12 июля на AE004091) Координаты CDS в записи EMBL: 3169 - 4278; 4275 - 6695 AC UniProt в записи EMBL: нет Записи в поле "product": product="RecF protein" и product="DNA gyrase subunit B"
Pasteurella multocida	-	Аннотация соответствующего фрагмента генома: -

Только в случае генома Pseudomonas aeruginosa вообще можно было бы предположить, что программа BLASTN нашла гомолог (о чем свидетельствуют характеристики выравнивания - в частности, Е-value<0,01; длина). Таким образом, программа BLASTN оказывается неэффективной для поиска гомологов кодирующих последовательностей. Это неудивительно, учитывая особенности алгоритма (так использование достаточно большого якоря в 11 пар нуклеотидов приводит к поиску строго идентичных, протяженных участков последовательности; чем якорь длиннее, тем больше вероятность "нахватать лишнего"). Вырожденность генетического кода так же снижает чувствительность программы.