Работа в базе данных UniProt. Сравнение белка предполагаемая Zn-зависимая пептидаза бактерии G.sulfurreducens PCA с белками-ортологами бактерий рода Geobacteraceae

       На занятиях по информатике мы уже успели поработать с такими базами данных как GBK, EMBL (базы данных нуклеиновых последовательностей) и PubMed (база данных публикаций). В этот раз наше задание связано с использованием базы данных последовательностей белков Uniprot.
       Для начала нужно было определить идентификатор белка в этой базе данных с помощью функции ID mapping: в поле для поиска я ввела идентификатор в Refseq, и на выходе получила ссылку на страницу моей пептидазы в базе данных.

       Далее я воспользовалась обычным поиском (Search), чтобы найти его ортологов. Начала я просто с поиска по названию белка: Peptidase lipoprotein. Результатом такого запроса оказалось 21,306 организмов, из которых в базе данных Swiss-Prot лежит 994 записи и в TrEMBL - 20,312. Тогда я рещила сократить выборку до пептидаз из семейства M48: Peptidase lipoprotein, M48 family.
По этому запросу нашлось 396 организмов, из которых 1 в Swiss-Prot и 395 в TrEMBL.

       Тогда я вспомнила определение ортологов. Ортологи - это гомологичные последовательности, разделившиеся в результате видообразования и выполняющие сходные функции. Раз схожие функции, значит класс белков должен совпадать, а разделение при видообразовании означает, что эти гомологи могут найтись в пределах одного рода. В итоге для расширенного поиска (Advanced search) подходят следующие поля: protein name [DE] - Peptidase lipoprotein, и Taxonomy [OC] - Geobacteraceae. В итоге Uniprot сфорфировал следующий запрос:

name:"Peptidase lipoprotein" AND taxonomy:Geobacteraceae

       По данному запросу найдено 6 результатов, среди которых пептидаза бактерии G.sulfurreducens PCA. Для дальнейшей работы я выбрала следующие два белка: пептидазу B5EB93 бактерии G.bemidjiensis Bem и пептидазу Q39WA0 бактерии G.metallireducens GS-15.
       Следующим этапом было получение файла с информацией о белке из Uniprot. Для этого я воспользовалась пакетом EMBOSS, установленном в PUTTY. Чтобы получить файлы, были сделаны следующие запросы:

entret uniprot:Q74D82
entret uniprot:Q39WA0
entret uniprot:B5EB93

       После получения информационных файлов о белках, было проведено их "исследование", результаты которого можно увидеть в таблице 1.

Таблица 1. Разбор Uniprot-файлов белков бактерий G.sulfurrreducens PCA, G.bemidjiensis Bem и G.metallireducens GS-15 (получено с помощью базы данных Uniprot).

       Как видно из таблицы 1, существование пептидаз B5EB93 бактерии G.bemidjiensis Bem и Q39WA0 бактерии G.metallireducens GS-15 было выявлено только при предположении, что у них должен быть такой же фермент, как и у их сородича, так что никаких глубоких исследований делать без крайней нужды не стали. Поэтому мною было проведено небольшое исследование на различие их строения. Обобщение результатов можно увидеть в таблице 2.

Таблица 2. Сравнение последовательностей белков бактерий G.sulfurrreducens PCA, G.bemidjiensis Bem и G.metallireducens GS-15 (получено с помощью базы данных Uniprot).

       Скачать данные таблицы можно здесь.

       Из таблицы 2 видно, что все три белка между собой очень похожи: выполняют одинаковые функции, имеют одинаковое местонахождение, один центральный атом и др. ДЛя этого практикума нам предлагалось раскрыть несколько вопросов о белке, мой выбор пал на следующие:

• В какой части бактериальной клетки локализован Ваш белок? На какой участок вашего белка Вы бы стали воздействовать,чтобы помешать его правильной локализации в клетке?

         Все пептидазы встроены в мембрану, что можно было предположить, исходя из расположения его гидрофобных кластеров. Поэтому чтобы нарушить его локализацию, я бы заменила большую часть этого гидрофобного "ядра" на гидрофильные цепочки, тогда белку будет невыгодно прятаться в липидном слое, и он уйдёт в цитоплазму.

• Какие аминокислотные остатки участвуют в образовании активного центра? (перечислите № позиций и полные названия)

         В активный центр пептидаз входит ион металла Zn2+ и связывающие его аминокислоты. У Q74D82 это валин 125, глицин 129, аспарагин 181 и пролин 227 (согласно Uniprot). Так как для двух других белков PDB-файлов нет, то я предположила, что у них связывающие аминокислоты будут иметь примерно такие же координаты: у Q39WA0 - гистидин 125, гистидин 129, глутаминовая к-та 181 и гистидин 227 (координаты я выбрала такие же, так как длина цепи отличается всего на одну аминокислоту), а у B5EB93 - гистидин 126, аланин 130, аспарагин 182 и пролин 228 (у этого белка я сместила номера на единицу вправо. Почему? Объяснено в разделе с α-спиралями.)

• Какие ионы связываются с белком?

         Ионы цинка - Zn2+.

• Получите последовательность 2-й альфа-спирали, используя команду seqret пакета EMBOSS.

         Извлечь аминокислотную последовательность можно с помощью команды seqret. Сначала для удобства я извлекла всю последовательность белка:

  seqret mybelok

         Далее я извлекла конкретно последовательность аминокислот, соответствующую 2-ой α-спирали (её координаты я посмотрела в файле PDB - они оказались 39..56). Для этого есть подфункция -sask1:

  seqret -sask1 seq
  Begin at position [start]: 39
  End at position [end]: 56
  output sequence(s) [q74d82_geosl.fasta]: seqhelix

         Аналогичным способом я получила последовательности α-спиралей двух других белков, предположив, что координаты их начал и концов совпадают. В случае с Q39WA0 это так и оказалось - сразу обнаружилось 12 совпадений по аминокислотам (из 18 возможных) - совпадающие аминокислоты выделена в таблице красным. А вот в случае с B5EB93 я заметила, что если сместить координаты на единицу вправо, то совпадений станет больше - 13 из возможных 18 (выделены синим). Возможно, это смещение обусловлено встраиванием лишней аминокислоты до последовательности альфа-спирали, ведь у этого онтолога длина цепи увеличилась уже на 4 аминокислоты.

Работа в базе оперонов DOOR2. Предсказание оперонов, включающих белки пептидаза и АТФ-синтаза

       Следующим заданием было знакомство с базой оперонов DOOR2. Оперон - это последовательность генов, лежащих друг за другом на цепи ДНК и считывающихся совместно в одну молекулу мРНК, образуя "заготовку" для клеточного компонента. В первом семестре я уже делала предположения о составе оперона АТФ-синтазы. Мои размышления основывались на со- и разнонаправленности генов. Сейчас мне нужно будет сравнить свои предположения с предположениями учёных, создавших DOOR2.
       Сначала я нашла оперон АТФ-синтазы с помощью следующего запроса: geobacter sulfurreducens | atpA. По этому запросу было найдено 2,886 записей, интересующая меня оказалась на 13-ом месте. оказалось, что в базе данных DOOR2 оперон АТФ-синтазы содержит всего 5 генов из предполагаемых мною 11 (на рисунке 1 изображены, какие опероны определены для этого белка).

Рисунок 1. Опероны, соответствующие 11 белкам, определённым мною как оперон АТФ-синтазы. Рисунок получен с помощью базы данных DOOR2. Расширенную версию можно посмотреть тут

       Согласно DOOR2, опероном АТФ-синтазы является оперон под номером 28646 (входящие в него гены перечислены в таблице 3), в то время как границы "моего оперона" распространяются ещё и на опероны 28645, 1428446, 1428447 и 28647. Определить однозначно, кто прав, невозможно, но у DOOR2 довольно высокий уровень предсказания: ~90%. И тем не менее, я удивлена, что atpX и atpC получили отдельные опероны, ведь они явно являются частями этой синтазы - B'-субъединица АТФ-синтазы Fo и ε-субъединица АТФ-синтазы типа FoF1 соответственно. Так что мне кажется, что здесь допущена погрешность, и в окончательный оперон входят 7 генов: atpX, atpF, atpH, atpA, atpG, atpD, atpC.

Таблица 3. Гены в опероне 28646 - предполагаемом опероне АТФ-синтазы бактерии G.sulfurrreducens PCA.

       Также в задании предлагалось найти оперон своего белка. По своему запросу: Geobacter sulfurreducens PCA | GSU1437 | M48 family peptidase, я получила 18 результатов, интересующая меня была 4-ой в очереди - ID 28921. В этот оперон, помимо гена пептидазы, входят ещё 6 генов. Информация о них представлена в таблице 4, а взаимное расположение изображено на рисунке 2.

Таблица 4. Гены в опероне 28921, содержащем Zn-зависимую пептидазу бактерии G.sulfurrreducens PCA.

Рисунок 2. Оперон 28921, соответствующий белку Zn-зависимой пептидазы и ещё 6 белкам. Рисунок получен с помощью базы данных DOOR2. Расширенную версию можно посмотреть тут