Учебная страница курса биоинформатики,
год поступления 2015

Семестры Студенты Преподаватели

• 2024
• 2023
• 2022
• 2021
• 2020
• 2019
• 2018
• 2017

• ...

Чтение последовательностей по Сэнгеру

1. Прочитать последовательность ДНК на основании данных, полученных из капиллярного секвенатора по Сэнгеру. Составить отчёт о проблемах при чтении хроматограмм

Пояснения.

Капиллярный секвенатор по Сангеру выдает файлы с хроматограммой и автоматически прочтенной последовательностью в формате .ab1.

Вам дано два файла в формате .ab1, соответствующие прочтению прямой и обратной цепочки секвенируемой ДНК. См. список данных, файлы лежат на диске P: в соответствующей директории ...term3/.../pr6/data

Для просмотра хромаьтограмм и редактирования автоматического прочтнения будем использовать программу Chromas (Lite).

Отчет должен быть представлен на странице вашего сайта.

Термины

Проблемный нуклеотид - тот, по которому вы приняли решение, отличное от предложенного программой, или вы согласились с программой, но необходимо было проанализировать хроматограммы и принять решение.

Проблемные нуклеотиды в последовательности выделяйте строчными буквами.

Полиморфизм - нуклеотид, про который вы решили, что в секвенируемой ДНК встречаются два (или более) варианта.

Полиморфизмы обозначайте кодами вырожденных нуклеотидов (ambiguity codes) - W: A или T; S: G или C; и т.п.

Что должно быть в отчёте.

• Ссылка на файл с результатом - последовательностью в fasta формате с выделенными строчными буквами проблемными нуклеотидами и полиморфизмами.

• Jalview проект с выравниваним прочтений прямой и обратной последовательности - тех частей, которые вы признали пригодными; выделите проблемные нуклеотиды и полиморфизмы.

• Обоснование ваших решений для четырех проблемных нуклеотидов или полиморфизмов:
  • картинка с выровненными хроматограммами окрестности проблемного нуклеотида, достаточной для оценки ситуации (три - четыре с каждой стороны)
  • ваше решение и обоснование
• Характеристику хроматограммы в целом:
  • длины начального и конечного нечитаемых участков (для обратной - после замены на комплементарную!)
  • оценку (на глаз) отношения сигнала и шума в среднем
  • неравномерность силы сигнала и шума вдоль последовательности
  • другие особенности
• Ссылки на исходные файлы в .ab1 формате (для удобства проверяющего)

Примерный порядок действий.

• откройте файл с прямой последовательностью
• вызовите еще раз Chromos, откройте файл с обратной последовательностью и перейдите к комплементарной цепочке
• настройте масштабы по вертикали и горизонтали; по горизонтали - одинаковый масштаб для двух окошек

• выровняйте две хроматограммы с использованием поиска подслов (find); повторять эту процедуру придется несколько раз - для каждого проблематичного нуклеотида или участка, т.к. выравнивание сбивается(увы, бесплатная версия не хочет выравнивать хроматограммы )

• определите и запишите в протоколе границы не читаемых 5'- и 3'-участков в каждой последовательности; координаты определяйте по прямой последовательности;
• удалите не читаемые 5'- и 3'- концы; для этого включите опцию Continuous edit

• охарактеризуйте на глаз качество каждой хроматограммы

• просмотрите всю прямую последовательность и отредактируйте ее
  • типичные сложные места:
    • шум выше среднего уровня шума и почти как сигнал;
    • пик на нетипичном расстоянии от соседей - вклинился лишний или, наоборот, соседние пики нетипично удалены
    • вместо двух или более пиков - один широкий
  • проверяйте сложные места по второй цепочке (если она имеется в данном месте)
• редактирование может состоять в
  • замене буквы
  • удалении лишней буквы
  • вставке буквы между предложенными софтом секвенатора
• все исправления должны быть маленькими буквами!
• сделайте то же со второй последовательностью

• сохраните обе последовательности в формате fasta и выровняйте их в JalView

Предостережения.

• Помните, что после "reverse comlement" конец прочтения окажется в начале перевернутой хроматограммы. Это существенно для понимания размера начальных некачественных участков.

• Все выравниватели в JalView маленькие буквы превращают в большие. Чтобы сохранить маленькие буквы выровняйте последовательности в JalView вручную (Shift + мышка или Ctrl + мышка позволяют двигать посл-ть). Готовясь, я поступал так: выравнивал программой, потом исхоные последовательности выравнивал вручную, глядя на выравнивание.

• На забудьте, что в JalView должна быть установлена раскраска по нуклеотидам!

2. Приведите пример не читаемого фрагмента хроматограммы

Фрагмент можно взять из любого файла. Совсем плохие хроматограммы см. в директории bad там же на диске P

Постарайтесь выбрать фрагмент, про который можно что-то написать.

В отчете - картинка и объяснение.

ААл