Учебная страница курса биоинформатики,
год поступления 2017

Семестры Студенты Преподаватели

• 2024
• 2023
• 2022
• 2021
• 2020
• 2019
• 2018
• 2016

• ...

Практикум 6. Чтение последовательностей по Сэнгеру

1. Получить последовательность ДНК на основании данных, полученных из капиллярного секвенатора. Составить отчёт о проблемах при чтении хроматограмм

Пояснения.

Капиллярный секвенатор выдает файлы с хроматограммой и автоматически прочтённой последовательностью в формате .ab1.

Вам дано два файла в формате .ab1, соответствующие прочтению прямой и обратной цепочки секвенируемой ДНК. См. список данных, файлы лежат на диске P в соответствующей директории: P:\y17\term3\block2\ab1_files.

Для просмотра хроматограмм и редактирования автоматического прочтения будем использовать программу Chromas (Lite).

Отчет должен быть представлен на странице вашего сайта.

Термины

Проблемный нуклеотид — тот, по которому вы приняли решение, отличное от предложенного программой, или вы согласились с программой, но необходимо было проанализировать хроматограммы и принять решение. Проблемные нуклеотиды в последовательности выделяйте строчными буквами.

Полиморфизм — это нуклеотид, про который вы решили, что в секвенируемой ДНК встречаются два (или более) варианта. Полиморфизмы обозначайте кодами вырожденных нуклеотидов (ambiguity codes), см. https://droog.gs.washington.edu/parc/images/iupac.html.

Что должно быть в отчёте.

• Ссылка на файл с результатом — последовательностью в fasta формате.

• JalView-проект с выравниванием прямого и обратного прочтений (тех частей, которые вы признали пригодными).

• Обоснование ваших решений для четырех-пяти проблемных нуклеотидов или полиморфизмов. Обоснование должно включать:

  • картинку с выровненными хроматограммами окрестности проблемного нуклеотида, достаточную для оценки ситуации (по три – четыре нуклеотида с каждой стороны);

  • ваше решение и обоснование.
• Характеристику хроматограммы в целом:
  • длины начального и конечного нечитаемых участков для прямого и обратного прочтений;
  • оценку (на глаз) отношения сигнала и шума в среднем;
  • неравномерность силы сигнала и шума вдоль последовательности;
  • другие особенности.
• Ссылки на исходные файлы в .ab1 формате (для удобства проверяющего).

Примерный порядок действий.

• Запустите Chromas, откройте файл с прямой последовательностью.
• Вызовите еще раз Chromas, откройте файл с обратной последовательностью и перейдите к комплементарной цепочке.

• Настройте масштабы по вертикали и горизонтали; по горизонтали — одинаковый масштаб для двух окошек.

• Найдите соответствующие участки двух хроматограмм. Разумно использовать поиск подслов (find); повторять эту процедуру придется несколько раз, для каждого проблематичного нуклеотида или участка, т.к. выравнивание сбивается (увы, бесплатная версия не хочет выравнивать хроматограммы ).

• Определите и запишите в протоколе границы нечитаемых 5'- и 3'-участков в каждой последовательности; координаты определяйте по прямой последовательности.
• Удалите нечитаемые 5'- и 3'- концы; для этого включите опцию Continuous edit.

• Охарактеризуйте на глаз качество каждой хроматограммы.

• Просмотрите всю прямую последовательность и отредактируйте ее:
  • типичные сложные места:
    • шум выше среднего уровня шума и почти как сигнал;
    • пик на нетипичном расстоянии от соседей: вклинился лишний или, наоборот, соседние пики нетипично удалены;

    • вместо двух или более пиков — один широкий.

  • Проверяйте сложные места по второй цепочке (если она имеется в данном месте);
• Редактирование может состоять в:
  • замене буквы;
  • удалении лишней буквы;

  • вставке буквы между предложенными софтом секвенатора.
    Все исправления должны быть маленькими буквами!

• Проделайте то же со второй последовательностью.
• Сохраните обе последовательности в формате fasta.

• Выровняйте последовательности программой needle; выравнивание получите в формате fasta (читайте needle -help -verbose).

• Импортируйте в JalView, раскрасьте по нуклеотидам и сохраните проект.

Предостережения.

• Помните, что после "reverse complement" конец прочтения окажется в начале перевернутой хроматограммы. Это существенно для понимания размера начальных некачественных участков.

• Все выравниватели в JalView маленькие буквы превращают в большие, поэтому рекомендуется выравнивать needle'ом, а уже потом импортировать в JalView.

2. Приведите пример нечитаемого фрагмента хроматограммы

Фрагмент можно взять из любого файла. Совсем плохие хроматограммы см. в директории bad там же на диске P.

Постарайтесь выбрать фрагмент, про который можно что-то написать.

В отчете — картинка и объяснение.