Учебная страница курса биоинформатики,
год поступления 2020

Семестры Студенты Преподаватели

• 2023
• 2022
• 2021
• 2019
• 2018
• 2017
• 2016
• 2015

• ...

Инструкции пр. 10

1 Используйте базу данных Genome на NCBI, Browse by organism и свои знания о прокариотах :)

2 NPG-explorer установлен на kodomo. Можно построить нуклеотидный пангеном на kodomo. Однако визуализировать его удаленно командой qnpge не удастся, так как нужны специальные настройки для передачи графики с сервера на свой компьютер. Поэтому нужно установить NPG-explorer на свой компьютер. Либо построить НПГ на своем компьютере, либо скачать директорию с нуклеотидном пангеномом на свой компьютер, зайти в эту директорию и выполнить команду qnpge.

Если у вас Mac, то придется установить эмулятор linux, так как варианта под Mac у NPG-explorer нет. Узнайте как это делать, т.к. я не знаю.

Инструкция по установке NPG-explorer и построению НПГ здесь

Выдержки из инструкции

• Для построения НПГ надо создать новую директорию
• В этой директории надо создать nтекстовый файл с именем genomes.tsv, описывающий входные данные (см. в инструкции)
• Все поддиректории и файлы, создаваемые и используемые NPG-explorer имеют фиксированные имена. Поэтому все команды NPG-explorer

должны быть запущены в директории, содержащей файл genomes.tsv и имена входных и выходных файлов, как правило, не указываются.

План действий коротко

Как подготовить единственный входной файл genomes.tsv

• Формат genomes.tsv

all:embl:CP003309       Hino    chr1    c       Rickettsia rickettsii str. Hino
all:refseqn:CP003318.1  Hauke   chr1    c       Rickettsia rickettsii str. Hauke
all:embl:CP003311       Hlp2    chr1    c       Rickettsia rickettsii str. Hlp2
all:file:Rrickettsii_genomes/CP000766   Iowa    chr1    c       Rickettsia rickettsii str. Iowa 

• пять полей, разделители - табуляторы (а не пробелы)
• all - значит, что и последовательности, и аннотации генов берутся из одной и той же записи (формат допускает скачивание из разных файлов)

• embl - значит, что идентификатор INSDC - БД GeneBank или ENA; указывайте универсальные идентификаторы INSDC (не те, которые NC_...)

• refseqn - значит, что идентификатор БД Refseq (nucl)
• file - значит, что использовать уже скачанный файл

• Hino и т.п. - короткое название генома без пробелов и подчеркиваний, выдуманное составителем файла

• chr1 - название хромосомы; предполагается одинаковым у гомологичных хромосом/плазмид из разных геномов
• c - кольцевая; l - для линейных
• Далее - полное название штамма

Параметры, которые можно менять в файле npge.config

• MIN_IDENTITY = Decimal('0.9') значит, что во всех мажорных блоках пангенома доля консервативных позиций превышает 0.9.
• Examine вычисляет долю консервативных позиций в малом числе блоков и предлагает значение параметра MIN_IDENTITY
  • Не обязательно следовать рекомендации буквально, но уменьшить вычисленное значение, по крайней мере, на 0.05 стоит
• MIN_LENGTH = 100 значит, что все блоки пангенома, кроме m-блоков (т.е. минорных блоков), имеют не менее 100 позиций
• WORKERS = 1 значит, что задействовать один процессор. Это значение рекомендуется использовать на kodomo, чтобы не заблокировать задания других студентов
  • WORKERS = -1 значит, что использовать все процессоры компьютера

Все команды npge выдают на stdout и/или stderr протоколы выполнения. Следует сохранять протоколы, например: npge MakePangenome &> log_make

Аналитические файлы с полезной информацией

• pangenome/pangenome.info содержит сводную информацию про все типы блоков:
  • s-блоки - стабильные (коровые) блоки, по одному фрагменту из каждого генома
  • h-блоки - "полустабильные" блоки - по одному фрагменту из части геномов
  • u-блоки - и не блоки вовсе, а уникальные последовательности из одного генома, у них нет гомологов среди всех геномов, кроме самой себя
  • r-блоки - блоки с повторами, по крайней мере, в одном геноме

  • m-блоки - минорные блоки - короткие (<MIN_LENGTH) блоки, которые не удается включить в другие блоки

  • g-блоки - синтеничные участки из всех геномов, т.е. такие что в каждом из них s-блоки идут в том же порядке и в той же ориентации; максимальны по блине с этим свойством; начинаются с s-блока, заканчиваются s-блоком; включают блоки других типов, разделяющие s-блоки
• идентификатор блока r34x1201 устроен так: r - тип блока (от repeat); 34 фрагмента в блоке; 1201 позиций в выравнивании блока; иногда приходится добавлять "n1", "n2" и т.п. на конце чтобы сохранить уникальность имён
• pangenome/pangenome.bi содержит информацию по каждому блоку, включая информацию о том, фрагменты каких геномов входят в блок; удобен для
  • поиска крупных делеций/вставок (h-блоки и u-блоки)
  • анализа блоков с повторами
• Список глобальных блоков - синтений - см. в global-blocks/blocks.gbi
  • g-блоки (глобальные блоки) состоят из последовательно идущих во всех геномах s-блоков, перемежающихся блоками других типов (r-, h-, u- и m-)
• Последовательность глобальных блоков в каждом геноме см. в файле global-blocks/blocks.blocks. Для ответов на вопросы его удобно взять в Excel, транспонировать и выкинуть строчки, не содержащие g-блоков.

Визуализатор qnpge запускается в рабочей директории (ricketssii_npg в примере) БЕЗ ПАРАМЕТРОВ.

• Версия NPG-explorer'а под Win запаздывает по сравнению с версией под linux. Если дома Win то можно поступить так.
  • Запустить все программы, кроме qnpge, на kodomo
  • Скопировать директорию целиком на свой компьютер
  • Скачать на свой компьютер NPG-explorer под Win, версию - как рекомендуется на сайте
  • Возможно, получится скачать только файл qnpge.exe с диска /P.../pr10 и положить в директорию с пангеномом
  • Запустить qnpge
• Описывать графический интерфейс - неблагодарное занятие; и не буду это делать. qnpge позволяет:
  • искать по названию блока, гена или по последовательности (требуется точное совпадение)
  • сортировать таблицу блоков по любой колонке
  • копировать последовательности из нижнего окна: целые группы блоков из правого верхнего
  • показывать имена генов; сами гены выделены белым шрифтом в нижнем окне с выравниванием блока; разберитесь, как указывается их ориентация
  • быстро перемешаться в блоке с выравниванием; home, end, ctrl или shift + стрелочки
  • переключать выравнивание имен блоков с глобальных блоков вдоль хромосомы к выравниванию обычных блоков внутри глобального или промежуточного i-блока

1c Ядро нуклеотидного пангенома состоит из совокупности s-блоков. Это наиболее стабильная часть панегенома. По объединенному выравниванию s-блоков NPG-explorer вычисляет филогенетическое дерево геномов.

Информация про s-блоки и блоки других типов содержится в файле pangenome/pangenome.info . Приведены две оценки размер ядра: (1) The percentage of input length: 73.67% Это процент числа нуклеотидов в ядре от числа нуклеотидов во входных последовательностях (2) The percentage of total blocks' length: 61.65% Это процент числа колонок в объединенном выравнивании s-блоков от суммарного числа колонок во всех блоках НПГ

Для последнего вопроса воспользуйтесь визуализатором qnpge нуклеотидного пангенома. Посмотрите в презентации что такое g-блок. В g-блоке, по определению, все s-блоки идут в одном и том же порядке во всех геномах. Чтобы сравнить последовательности g-блоков во всех хромосомах, в верхнем меню выберите Global blocks.

Формат файла pangenom/pangenom.bi

block    fragments      
 |       |       cols   ident-nogap     
 |       |       |      |       ident-gap       
 |       |       |      |       |       noident-nogap   
 |       |       |      |       |       |       noident-gap     
 |       |       |      |       |       |       |       pure-gap        
 |       |       |      |       |       |       |       |       ident   GC      JJA NT11058 Taiwan19F-14
r6x302   6      302     290     0       12      0       0       0.9602  0.3084  2   2       2
s3x703   3      703     693     0       10      0       0       0.9857  0.3086  1   1       1
h2x2385  2      2385    2155    6       224     0       0       0.9048  0.3089  1   1       0
r2x110n1 2      110     105     0       5       0       0       0.9545  0.309   0   2       0
s3x1238  3      1238    1178    25      33      2       0       0.9616  0.3091  1   1       1
u1x126n2 1      126     126     0       0       0       0       1       0.3095  0   1       0
m1x84n1  1      84      84      0       0       0       0       1       0.3095  0   0       1

• block - имя блока: s3x1238 = s - тип блока, 3 - число фрагментов в блоке, x - разделитель,1238 - число колонок в выравнивании блока; m1x84n1 - n1 добавлено потому, что уже был блок с именем m1x84
• ident-nogap - число абсолютно консервативных позиций
• ident-gap - число позиций, в которых есть гэпы, а остальные буквы совпадают
• noident- .... аналогично для позиций с двумя или более буквами
• pure-gap - полностью гэповые колонки. Полагаю всегда будет 0, могут появиться только в подблоках
• ident - доля консервативных позиций в выравнивании блока. Кажется считаются ident-nogap и ident-gap с коэффициентом 0.5
• JJA, NT11058 и Taiwan19F-14 - короткие имена трех геномов. В ячейке указано число фрагментов в указанном блоке из указанного генома. Подумайте, какие числа могут быть в зависимости от типа блока.

Известный bug npge Prepare.

Случается, если в записи ген начинается в конце записи и заканчивается РОВНО ОДНИМ нуклеотидом - первым - в начале записи. Такое не исключено для кольцевых хромосом. Пример (был, но этот придумал):

FT   gene            join(4670170..46700769,1)

Или наоборот начинается последним нуклеотидом и продолжается начиная с первого нуклеотида последовательности. Пример: 

FT   gene            join(5466652,1..263)
 
Сообщение об ошибке выглядит примерно так:

std::logic_error: 'algo/AddGenes.cpp:240: virtual void npge::AddGenes::run_impl() const: Assertation `(boundaries.size() % 2) == (0)' failed.
Error message `1 == 0'.'


Лечится так. 
Скачать запись
Найти такую ситуацию grep ',1)'  в первом случае или grep ',1..' во втором.
Исправить вручную на 

join(4670170..46700769,1..1)  в первом случае и на

join(5466652..5466652,1..263) во втором

Указать считывание этого генома из локального файла

Не поверите, но обе ситуации у меня встречались и портили настроение. На сотни пангеномов по одному разу. 

Исправлю, все руки не доходили :(