Занятие 8. Программы пакета BLAST для работы с нуклеотидными последовательностями

• st_genome.fasta включает последовательности из EMBL, составляющие полный геном сальмонеллы Salmonella typhimurium (возбудителя сальмонеллёза человека и мышиного тифа);
• xc_genome.fasta - полный геном возбудителя чёрной гнили капусты Xanthomonas campestris;
• pm_genome.fasta - полный геном бактерии Pasteurella multocida.

Поиск в геноме участков, кодирующих белки, похожие на заданный

Известна аминокислотная последовательность белка из Escherichia coli K-12.
Задача — определить, закодированы ли похожие белки в геноме другого организма, не пользуясь аннотацией генома.
Для выполнения задачи:



Я создал в своей рабочей директории индексные файлы пакета BLAST для поиска по геному X.campestris.
Команда:(в bash)
formatdb -i xc_genome.fasta -p F -n xc
Файлы на выходе:
xc.nhr,xc.nih,xc.ncq

Используя программу TBLASTN пакета BLAST,провел соответствующий поиск участков с порогом на E-value 0,001.

Команда:
blastall -p tblastn -d xc -i pur3_ecoli.fasta -o out.txt -e 0.001 Файл на выходе:

out.txt

Результы поиска:

Поиск гомологов белка PUR3_ECOLI в геноме бактерии Xanthomonas campestris

Число находок с Е-value<0,001		3
Характеристика лучшей находки:
	E-value находки	3e-42
	AC соответствующей записи EMBL	AE012391
	Координаты выравнивания(-ий) в записи EMBL	10100-10702
	Координаты CDS в записи EMBL (если есть)	10094-10747
	AC UniProt для этого CDS (если есть)	Q8P723

Аналогичный поиск сразу в нескольких геномах

Создайте индексные файлы BLAST для поиска по всем трем геномам сразу.
Команды:
Заводим две переменные:

- genpath=/home/export/samba/public/y07/Term3/EMBL
- genomes="$genpath/st_genome.fasta $genpath/xc_genome.fasta $genpath/pm_genome.fasta"

Используем команду formatdb:
formatdb -i "$genomes" -p F -n all.

Далее:
blastall -p tblastn -d all -i pur3_ecoli.fasta -o out.txt -e 0.001.
Выходные файлы:
out_all.txt

E-value лучшей находки: e-106
Ee AC: AE008812
Ор-м: Salmonella typhimurium
Число находок с E-value < 0,001 : 10

Поиск гомологов с помощью программы BLASTN

1.Для выполнения задания использовал запись EMBL:m13747
2.Нашел в ней координаты соответствующей CDS и вырезал последнюю программой seqret в отдельный файл.

Полученный файл:
m13747.fasta

3.Провел поиск гомологов этого гена в трёх геномах программой BLASTN.
Полученныe файлы:

out1.txt(E-value 0.001)
out2.txt(без огран-я)

В р-те:

Файл out1.txt содержит только одну находку.
Эта находка из ор-ма Salmonella typhimurium.
AC(EMBL):AE008812
В полученном файле имеются два выравнивания:


 Score =  238 bits (120), Expect = 1e-62
 Identities = 315/380 (82%)
 Strand = Plus / Plus

                                                                         
Query: 238   cccgatgtggtcgtgctggctggttttatgcgcattctcagcccggcgtttgtctcccac 297
             |||||||||||||||||||| ||||||||||| ||||| || |||  ||||||| | || 
Sbjct: 17336 cccgatgtggtcgtgctggccggttttatgcgtattctgagtccgatgtttgtcgcgcat 17395

                                                                         
Query: 298   tatgccgggcgtttgctgaacattcacccttctctgctgccgaaatatcccggattacac 357
             ||   ||||||| ||||||||||||||||||| ||||| || |||||||| || || || 
Sbjct: 17396 tactacgggcgtctgctgaacattcacccttccctgctaccaaaatatccggggttgcat 17455

                                                                         
Query: 358   acccatcgtcaggcgctggaaaatggcgatgaagagcacggtacatcggtgcatttcgtc 417
             |||||||| |||||||||||||| |||||||| ||||||||||| ||||| |||||||| 
Sbjct: 17456 acccatcgccaggcgctggaaaacggcgatgaggagcacggtacctcggtacatttcgtg 17515

                                                                         
Query: 418   accgatgaactggacggtggcccggttattttacaggcgaaagtcccggtatttgctggt 477
             || || ||||| ||||| |||||||| ||| | |||||||| || ||||| |||||    
Sbjct: 17516 acagacgaactcgacggcggcccggtcattctccaggcgaaggtgccggtttttgccaac 17575

                                                                         
Query: 478   gattcggaagatgacatcaccgcccgcgtgcaaacccaggaacacgccatttatccactg 537
             ||    |||||||| |||||||| ||||| || || |||||||| || |||||||| |||
Sbjct: 17576 gacagcgaagatgatatcaccgcacgcgtacagactcaggaacatgcgatttatccgctg 17635

                                                                         
Query: 538   gtgattagctggtttgccgatggtcgtctgaaaatgcacgaaaacgccgcgtggctggat 597
             |||||||||||||||||  | || ||||| || |||| ||| |||||||| |||||||| 
Sbjct: 17636 gtgattagctggtttgcgcaggggcgtctaaagatgcgcgataacgccgcctggctggac 17695

                                 
Query: 598   ggtcaacgtctgccgccgca 617
             || |  ||||||||||||||
Sbjct: 17696 gggcgtcgtctgccgccgca 17715

и

Score =  155 bits (78), Expect = 2e-37
Identities = 123/138 (89%)
Strand = Plus / Plus

                                                                         
Query: 1     atgaatattgtggtgcttatttccggcaacggaagtaatttacaggcaattattgacgcc 60
             ||||||||||||||||| ||||||||||| ||||| ||||||||||| ||||| || |||
Sbjct: 17099 atgaatattgtggtgctgatttccggcaatggaagcaatttacaggcgattatcgatgcc 17158

                                                                         
Query: 61    tgtaaaaccaacaaaattaaaggcaccgtacgggcagttttcagcaataaggccgacgcg 120
             ||  || | || ||||||||||||||| |  ||||||| |||||||||||||||||||||
Sbjct: 17159 tgcgaagcgaagaaaattaaaggcaccctcagggcagtattcagcaataaggccgacgcg 17218

                               
Query: 121   ttcggccttgaacgcgcc 138
             ||||||||||||||||||
Sbjct: 17219 ttcggccttgaacgcgcc 17236

Соответственно E-value лучшей находки 1e-62

Аннотация соответствующего фрагмента генома Salmonella typhimurium LT2 приведена здесь. 
                                                                          

Cравнение с предыдущим упражнением:

В отличии от вторго упражнения, когда на вход программе подавалась аминокислотная последовательность белка находка в упражнении 3 (на вход подавалась нуклеотидная последовательность гена) при ограничении на E-value оказалась всего одна (во втором упр-ии находок было 10).
1.По результатам выравниваний в обоих упражнениях лучшей была находка из ор-ма Salmonella typhimurium с AC:AE008812.
2.Отличие в выравниваниях заключено в значениях score.
Во 2-м упражнении score лучшей находки - 379.
В 3-м упражнении score лучшей находки - 238.
При выравнивании нуклеотидных последовательностей заданного гена и найденного гена этой бактерии
процент идентичности равен 82%.
совпадают 315 из 380 нуклеотидов.
В предыдущем же упражнении процент идентичности равен 87%.
и совпадают 186 из 212 аминокислотных остатков.
В р-те можно сделать вывод о том, что аминокислотная последовательность более консервативна (в отличии от генетического кода).