|
|
|
|
|
|
Блок 2: последовательности нуклеиновых кислот.
Практика 3: программа getorf.
Поиск гомологов некодирующих участков.
Задание 1. Работа с программой getorf пакета EMBOSS.
Выполнена команда:
getorf -sequence d89965.fasta -minsize 30 -table 0 -find 1 -outseq d89965.orf
Программа getorf осуществляет поиск открытых рамок считывания последовательности:
| -sequence d89965.fasta | файл с последовательностью на вход |
| -minsize 30 | минимальная длина рамки (по умолчанию 30) |
| -table 0 | таблица генетических кодов (можно не писать, по умолчанию 0) |
| -find 1 | открытая рамка считывания включает стоп-кодон |
| -outseq d89965.orf | файл с результатом |
Открытая рамка считывания:
>D89965_5 [163 - 432] Rattus norvegicus mRNA for RSS, complete cds.
MALMHFQFTFKQFEQRKSIRSTARKARDDFVVVQTADLFHVAFHYGIAQRGLTITSDDHM AVTAYAYYSCHELTPWLRIQSTNPVQKYGA
соответствует кодирующей последовательности (CDS).
Открытая рамка считывания, соответствующая последовательности белка HSLV_ECOLI (из записи UniProt), но не всей ,а только 28-125 остаткам ( длина всего белка-176 остатков):
>D89965_9 [294 - 1] (REVERSE SENSE) Rattus norvegicus mRNA for RSS, complete cds.
MKGNVKKVRRLYNDKVIAGFAGGTADAFTLFELFERKLEMHQGHLVKAAVELAKDWRTDRMLRKLEALLAVADETASL IITGNGDVVQPENDLIAIGS
Последовательности совпадают почти полностью (если сделать выравнивание для всей последовательности Rattus norvegicus mRNA и белка HSLU_ECOLI, то выравнивание будет идентичным уже не 97, а 125 а.о.), хотя они взяты из разных организмов:первая - из Rattus norvegicus, а вторая (на которую ссылается данная запись EMBL) - из Escherichia coli. Такое несоответствие можно объяснить тем, что кодирующая последовательность в записи EMBL была определена неправильно: вместо крысы, возможно, была отсеквенирована кишечная палочка, которая жила в её пищеварительном тракте. На SwissProt мы полагаемся, так как это курируемая база данных.
Задание 2. Поиск гомологов некодирующих последовательностей программой BLASTN.
Результаты работы представлены в виде таблицы.
Задание 3. Поиск гомологов при измененных параметрах программы BLASTN.
1) blastn -query trna_bacsu.fasta -db hh -out trna2.fasta -evalue 0.01 -task blastn -outfmt 6 -reward 5 -penalty -4 -gapopen 10 -gapextend 6
2) blastn -query trna_bacsu.fasta -db hh -out trna3.fasta -evalue 0.01 -task blastn -outfmt 6 -reward 5 -penalty -4 -gapopen 10 -gapextend 6 -word_size 4
3) blastn -query trna_bacsu.fasta -db hh -out trna4.fasta -evalue 0.01 -task blastn -outfmt 6 -word_size 4
4. Анализ результатов.
При изменении значений -reward и -penalty от 2 до 5 и -3 до -4 соответственно в большинстве случаев число гомологов увеличилось или не изменилось. Однако встречалось и уменьшение числа гомологов, но таких случаев было гораздо меньше. При уменьшении длины слова количество гомологов увеличилось, и лишь в незначительном количестве случаев не изменилось.
Для анализа программой needlе были выбрана пара гомологов, которая есть при весовой матрице с парамтрами -reward 5 и -penalty -4, но отсутствует при стандартных значениях этих параметров. Это BSn5_t20966 на участке 5-63 и AL591977 на 46660-46717
| query id | subject id | identity, % | align- ment length |
mis- mat- ches |
gap opens | q. start | q. end | s. start | s. end | evalue | bit score |
| BSn5_t20966 | embl| AL591977| AL591977 |
76.27 | 59 | 13 | 1 | 5 | 63 | 46660 | 46717 | 2e-05 | 40.8 |
В результате парного выравнивания:
# Aligned_sequences: 2
# 1: BSn5_t20966
# 2: AL591977
# Matrix: EDNAFULL
# Gap_penalty: 10.0
# Extend_penalty: 0.5
#
# Length: 59
# Identity: 45/59 (76.3%)
# Similarity: 45/59 (76.3%)
# Gaps: 1/59 ( 1.7%)
# Score: 163.0
#
#
#=======================================
BSn5_t20966 1 ctgtagctcagctggttagagcgcacgcctgataagcgtgaggtcggtgg 50
|.|||||||||.||| ||||||...||.|||.|||.||...|||||..||
AL591977 1 cagtagctcagttgg-tagagcaatcggctgttaaccgatcggtcgcagg 49
BSn5_t20966 51 ttcgagtcc 59
|||||||||
AL591977 50 ttcgagtcc 58
Следует обратить внимание, что выравниваемые последовательности тРНК различаются главным образом в центре (соответствующем антикодоновой петле), а их края (соответствующие акцепторному черешку) вообще не выровнялись, это напрямую связано с функциями этих тРНК. Дело в том, что гомологичный участок является частью последовательности, продуктом которой является tRNA-Asn (в соответствии с полем FT записи EMBL, описывающей геном бактерии). Продуктом же BSn5_t20966 является tRNA-Ile.
|