Изменения структуры при связывании лиганда
В этом практикуме мы работаем со структурой тирозинкиназы ABL1, участвующей во множестве ключевых для жизни клетки процессов: от клеточного движения до апоптоза. В частности, фосфорилируя различные белки, она координирует ремоделирование актина, эндоцитоз и аутофагию, а также обладает ДНК-связывающей активностью и участвует в ответе на провеждения ДНК. Показано, что ингибиторы данной киназы могут подавлять развитие некоторых видов раковых опухолей, в связи с чем их подбор представляет особый интерес [1].
PD166326 - соединение класса пиридопиримидинов (рис. 1), довольно эффективно ингибирующее ABL1 [2]. Мы будем рассматривать две структуры ABL1: в комплексе с данным соединением и свободную форму - и сравним их между собой, чтобы предположить, как происходит и чем обусловлено связывание ингибитора.
При рассмотрении одновременно свободной и связанной с PD166326 форм главное, что бросается в глаза - это участок, который на рис. 2 расположен слева от лиганда. Там в свободной форме есть небольшой бета-листовой кусочек, а в связанной образуется петля.
Однако прежде всего рассмотрим, как в целом организован карман связывания PD166326 (рис. 3). Лиганд, по-видимому, образует только две водородных связи с остовом белка (обе с метионином-337), а в остальном эффективность взаимодействия обеспечивается, вероятно, за счет формы кармана. К лиганду обращены несколько гидрофобных остатков (остатки лейцина, валина, фенилаланина, тирозина).
Теперь обратим внимание на остатки, для которых на рис. 3 отмечены названия. Метионин-337, как было сказано выше, интересен нам тем, что образует атомами остова две водородных связи с лигандом, а остальные остатки позволят нам подчеркнуть некоторые различия свободной и связанной форм ABL1.
Посмотрим на рис. 4, где сайт связывания показан под одним и тем же углом в свободной и связанной форме. Видим, что в свободной форме K271 образует солевые мостики с остатками E286 и D381 (нумерация атомов в структуре ABL1 в связанной форме "смещена" на 19 атомов по сравнению со свободной формой, т.е. в ней это остатки K290, E305 и D400). В то же время, в связанной форме аспартат-400 отстоит от лизина-290. Это может быть связано с тем, что фенилаланин, расположенный через один остаток от данного аспартата, участвует в формировании гидрофобного кармана для PD166326, и этот участок цепи меняет свою конфигурацию (на рис. 4 видим, что по отображаемой в PyMOL разметке вторичной структуры данный фенилаланин в свободной форме расположен на краю небольшого альфа-спирального участка, а в связанной форме этот спиральный участок исчезает).
Теперь посмотрим внимательнее на тот самый участок бета-листа, присутствующий только в свободной форме, на который мы обратили внимание еще на рис. 2. На рис. 4 он виден слева сверху (мы смотрим на него как бы сбоку). Заметим, что в петле, идущей за этим участком, расположен остаток тирозина-253 (он же тирозин-272 в структуре связанной формы), который в присутствии лиганда может образовывать водородную связь с аспарагином-341 (322 в свободной форме). В свободной форме этот же аспарагин расположен довольно далеко, и это, наверное, наиболее существенная перестройка цепи, которую мы обнаруживаем при сравнении двух данных структур.
Структура самого бета-листового участка, отсутствующего в связанной с PD166326 форме, изображена на рис. 5 с некоторыми возможными водородными связями.
На рис. 6 изображена петля, присутствующая в связанной с PD166326 форме вместо бета-листового участка. Тут тоже формируются водородные связи между атомами остова, а также уже упомянутая выше связь с аспарагином (рис. 6A). Как видно из рис. 6B, при данной конфигурации петли в сторону лиганда обращены боковые цепи лейцина и валина, а боковая цепь тирозина "замыкает" с одной из сторон карман связывания.
Карманы в свободной и связанной формах ABL1 можно обнаружить с помощью сервиса POCASA. На рис. 7 изображена свободная форма с обнаруженными карманами. Карман связывания PD166326 - второй по размеру, его объем - 187 ų (ID кармана - 398).
В связанной форме карман PD166326 несколько меньше по объему (141 ų), его ID - 379, и он, как и в случае свободной формы, второй по объему. Все карманы с их ID изображены на рис. 8. Как мне кажется, POCASA в обеих формах действительно обнаружил все имеющиеся карманы: в остальных участках ABL1 боковые цепи расположены довольно плотно.
На рис. 9 приведено сравнение кармана связывания PD166326 в свободной и связанной форме. Видно, что карман связанной формы практически точно соответствует форме самого лиганда. При этом он заметно более вытянутый, а значит по результатам применения POCASA можно предположить, что между белком и лигандом существует индуцированное соответствие, т.е. еще в процессе связывания PD166326 воздействует на белок, изменяя его структуру в данном участке, т.к., возможно, в первоначально имеющийся карман лиганд просто не может войти целиком.
Можно заключить, что PD166326 - ингибитор тирозинкиназы ABL1 - воздействует на белок либо в процессе связывания (в пользу чего говорят обнаруженные POCASA карманы), либо после связывания и заметно изменяет его структуру в соответствующем участке, сближая до того отдаленные друг от друга остатки и даже внося изменения в элементы вторичной структуры.
Протонирование, подготовка к докингу
Попробуем применить докинг, чтобы оценить, как PD166326 может связаться со свободной формой ABL1.
Для докинга необходимо протонировать свободную форму белка, а также лиганд. Белок мы протонировали с помощью сервиса PDB2PQR, а лиганд - с помощью программы SPORES. На рис. 10 показан лиганд PD166326 до и после добавления протонов.
То, как SPORES добавила протоны, выглядит совершенно разумным.
Докинг
Теперь мы можем применить докинг.
На полученных нами протонированных белке и лиганде мы запустили веб-сервис для докинга Webina. Он выдал девять поз для лиганда. Надо сказать, что все, кроме двух из этих поз, довольно близки к положению PD166326 в структуре связанной с ним формы ABL1 (рис. 11).
Только в одной позе из Webina атом углерода с гидрокисльной группой смотрит в ту же сторону, что в структуре в связанной форме, именно ее мы и выберем в качестве наилучшей (рис. 12).
Теперь с помощью PoseView попробуем выделить взаимодействия, которые могут образовываться между лучшей позой ингибитора из Webina и свободной формой ABL1. Они приведены на рис. 13, а их визуализация в структуре - на рис. 14. Мы видим, что ничего не мешает PD166326 образовать те самые две водородные связи с метионином, о которых мы говорили еще в задании один, а также PosView вполне смог выделить остатки, которые образуют подходящий для лиганда карман.
Если мы посмотрим на выдачу PoseView для связанной формы с ее лигандом (рис. 15 и 16), то увидим ту же картину, которую мы описывали в задании 1 до применения PoseView, разве что PoseView делает акцент на других остатках, чем это сделали мы.
Возможность образования свободной формой тех же водородных связей с лигандом, что и связанной, а также наличие остатков, способных образовывать еще в свободной форме подходящий для PD166326 карман, дают нам возможность предположить, что структурные изменения в ABL1, описанные нами в первом задании, происходят уже после непосредственного связывания ингибитора. Это говорит о том, что сделанное нами в результате применения POCASA предположение о наличии индуцированного соответствия, по-видимому, не является верным. Вероятно, выбрав меньший радиус пробы в POCASA (например, 1 Å), мы бы увидели, что карман для связывания вполне имеется и в свободной форме ABL1, пусть его форма и не так идеально соответствует форме PD166326, как в связанном с этим лигандом белке.
Список литературы
1. Characterization of Potent Inhibitors of the Bcr-Abl and the c-Kit Receptor Tyrosine Kinases. David Wisniewski, Caryl L. Lambek, Chongyuan Liu, Annabel Strife, Darren R. Veach, Bhushan Nagar, Matthew A. Young, Thomas Schindler, William G. Bornmann, Joseph R. Bertino, John Kuriyan and Bayard Clarkson. Cancer Res August 1 2002 (62) (15) 4244-4255.
2. Wolff NC, Veach DR, Tong WP, Bornmann WG, Clarkson B, Ilaria RL Jr. PD166326, a novel tyrosine kinase inhibitor, has greater antileukemic activity than imatinib mesylate in a murine model of chronic myeloid leukemia. Blood. 2005;105(10):3995-4003. doi:10.1182/blood-2004-09-3534.