Reading Sanger sequencing

Задание 1. По результатам хроматограмм из капиллярного секвенатора по Сэнгеру и последовательности, сгенерированной программой, получить последовательность фрагмента ДНК

Капиллярный секвенатор по Сангеру выдает файлы с хроматограммой и последовательностью в формате .ab1. Для просмотра и редактирования использовали программу Chromas (Lite).

Прямая последовательность исходная

Обратная комплементарная последовательность исходная

Прямая последовательность с удаленными нечитаемыми участками

Обратная комплементарная последовательность с удаленными нечитаемыми участками

Отредактированная прямая последовательность

Отредактированная обратная комплементарная последовательность

1. Удаление нечитаемых участков

Нечитаемые участки: прямая цепь 5'-конец до 50 нуклеотида (много N, пики хаотично накладываются друг на друга); 3'-конец - с 840 и до конца (932). Обратная цепь (по координатам из прямой цепи): 5'-конец до 140, 3'-конец - с 900 и до конца.

2. Характеристика качества хроматограммы:

Прямая цепь:

• Уровень сигнала превосходит уровень шума в среднем примерно в 12-14 раз

• В среднем шум равномерный с редкими отклонениями

• Сигнал от гуанина и аденина сильнее.

• Особенностью является то, наблюдаются неразделенные пики.

Обратная цепь :

• Уровень сигнала превосходит уровень шума в среднем примерно в 12-14 раз

• В среднем шум равномерный с редкими отклонениями

• Сигнал от цитозина и тимина сильнее.

• Особенностью является то, что что наблюдается перекрывание сигналов и неразделенные пики.

2. Редактирование последовательности

Последовательности были выравнены друг под другом

Сверху – исходная последовательность, а снизу обратная – комплементарная.

• Проблема №1. Размытые пики

На данном месте я поставила Т, так как пик был только от тимина, что согласуется с прямой последовательностью.

• Проблема №2. Слабый сигнал.

На данном месте я поставила G, так как его пик выше, чем пик А

• Проблема №3. Перекрывающиеся пики

Здесь я поставила Т, ориентируясь на обратную последовательность.

• Проблема №4. На данной позиции все очевидно.

4. Последовательности были выравнены muscle в Jalview

Проект Jalview с выравниванием

Задание 2.Приведите пример не читаемой хроматограммы

Плохая хроматограмма

В данной хроматограмме уровень сигнала совпадает с уровнем шума. Также наблюдаются различные уровни сигнала. При этом все пики, превышающие шумы, размыты и непригодны для идентификации. Три определенных программой нуклетотида следует считать скорее случайным совпадением.

Anna Zheltova

Задание 2.Приведите пример не читаемой хроматограммы