Занятие 7: BLAST

При выполнении заданий использовался web-интерфейс к BLASTp на сервере NCBI.

Поиск гипотетических гомологов белка CDD_BACSU в разных банках

C помощью программы BLASTp произведём поиск гомологов белка CDD_BACSU (AC P19079) в банках Swiss-Prot, PDB и nr.

Таблица 1. Результаты поиска гипотетических гомологов белка CDD_BACSU

Следует также обратить внимание на следующие моменты:
• исходный белок CDD_BACSU удалось найти в Swiss-Prot и nr, а его структуру - в PDB;
• число явных гомологов (E-value < 1e-10) при поиске по базе данных nr заметно больше, чем при поиске в других базах данных (если снять ограничение в 100 отображаемых результатов, то мы сможем найти 1720 явных гомологов); это вполне объяснимо, если учесть тот факт, что nr включает в себя все белковые последовательности (17612906 последовательностей по состоянию на 24 марта 2012 года; это на 2 порядка больше, чем 450602 последовательностей в Swiss-Prot, и на 3 порядка больше, чем 57172 в PDB) из всевозможных источников (а именно: All non-redundant GenBank CDS translations+ PDB+SwissProt+PIR+PRF excluding environmental samples from WGS projects);
• общее количество находок (при параметрах по умолчанию) - 91, 28 и 100 в Swiss-Prot, PDB и nr соответственно; в первых двух случаях число находок было лимитировано значением E-value (равным соответственно 9.0 и 4.2 для последней находки), в последнем, как уже было отмечено, - заданным по умолчанию предельным размером выдачи (если в последнем случае повысить предельный размер выдачи, то мы получим 2426 находок).

Поиск гипотетических гомологов белка CDD_BACSU с фильтром по таксонам

Таксономия Bacillus subtilis:

Для поиска лучшего гомолога в организмах таксона, филогенетически как можно более далекого, предлагаются следующие таксоны:

Установленный критерий наличия гипотетического гомолога - E-value < 0,001.

При выполнении поиска в порядке приближения к Bacillus subtilis первый гомолог найден в царстве Eukaryota. Это оказалась цитидин-дезаминаза человека.

Сравнение выравниваний, выданных программой BLASTp, с оптимальными глобальным и локальным выравниваниями

Для сравнения используем выравнивание BLASTp последовательностей белка CDD_BACSU (AC P19079) и белка CDD_HUMAN (AC P32320), которое было получено при выполнении предыдущего задания.

>sp|P32320.2|CDD_HUMAN  RecName: Full=Cytidine deaminase; 
AltName: Full=Cytidine aminohydrolase
Length=146

 GENE ID: 978 CDA | cytidine deaminase [Homo sapiens] (Over 10 PubMed links)

 Score =  127 bits (320),  Expect = 3e-40, Method: Compositional matrix adjust.
 Identities = 66/129 (51%), Positives = 90/129 (70%), Gaps = 2/129 (2%)

Query  4    QELITEALKARDMAYAPYSKFQVGAALLTKDGKVYRGCNIENAAYSMCNCAERTALFKAV  63
            Q+L+  + +A+  AY PYS F VGAALLT++G++++GCNIENA Y +  CAERTA+ KAV
Sbjct  16   QQLLVCSQEAKKSAYCPYSHFPVGAALLTQEGRIFKGCNIENACYPLGICAERTAIQKAV  75

Query  64   SEGDTEFQMLAVAADTPGP-VSPCGACRQVISELCTKDVIVVLTNLQGQIKEMTVEELLP  122
            SEG  +F+ +A+A+D     +SPCGACRQV+ E  T +  V +T   G    MTV+ELLP
Sbjct  76   SEGYKDFRAIAIASDMQDDFISPCGACRQVMREFGT-NWPVYMTKPDGTYIVMTVQELLP  134

Query  123  GAFSSEDLH  131
             +F  EDL 
Sbjct  135  SSFGPEDLQ  143

Функция веса, использованная при построении:
• матрица весов замен - BLOSUM62;
• штраф за создание гэпа - 11;
• штаф за удлинение гэпа - 1.

Программа needle пакета EMBOSS выдаёт оптимальное полное выравнивание.

Для построения оптимального полного выравнивания последовательностей белков CDD_BACSU (AC P19079) и CDD_HUMAN (AC P32320) при той же функции веса выполним следующую команду:

needle sw:p19079 sw:p32320 cdd_bacsu-cdd_human.needle -gapopen 11 -gapextend 1

В результате получим файл cdd_bacsu-cdd_human.needle.

Полученное программой needle оптимальное полное выравнивание:

CDD_BACSU          1 ------------MNRQELITEALKARDMAYAPYSKFQVGAALLTKDGKVY     38
                                 ...|:|:..:.:|:..||.|||.|.|||||||::|:::
CDD_HUMAN          1 MAQKRPACTLKPECVQQLLVCSQEAKKSAYCPYSHFPVGAALLTQEGRIF     50

CDD_BACSU         39 RGCNIENAAYSMCNCAERTALFKAVSEGDTEFQMLAVAADTPGP-VSPCG     87
                     :|||||||.|.:..||||||:.||||||..:|:.:|:|:|.... :||||
CDD_HUMAN         51 KGCNIENACYPLGICAERTAIQKAVSEGYKDFRAIAIASDMQDDFISPCG    100

CDD_BACSU         88 ACRQVISELCTKDVIVVLTNLQGQIKEMTVEELLPGAFSSEDLHDERKL    136
                     |||||:.|..| :..|.:|...|....|||:||||.:|..|||...:  
CDD_HUMAN        101 ACRQVMREFGT-NWPVYMTKPDGTYIVMTVQELLPSSFGPEDLQKTQ--    146

Для построения оптимального частичного выравнивания используем программу water пакета EMBOSS. Выполним команду:

water sw:p19079 sw:p32320 cdd_bacsu-cdd_human.water -gapopen 11 -gapextend 1

В результате получим файл cdd_bacsu-cdd_human.water.

Полученное программой water частичное выравнивание:

CDD_BACSU          4 QELITEALKARDMAYAPYSKFQVGAALLTKDGKVYRGCNIENAAYSMCNC     53
                     |:|:..:.:|:..||.|||.|.|||||||::|::::|||||||.|.:..|
CDD_HUMAN         16 QQLLVCSQEAKKSAYCPYSHFPVGAALLTQEGRIFKGCNIENACYPLGIC     65

CDD_BACSU         54 AERTALFKAVSEGDTEFQMLAVAADTPGP-VSPCGACRQVISELCTKDVI    102
                     |||||:.||||||..:|:.:|:|:|.... :|||||||||:.|..| :..
CDD_HUMAN         66 AERTAIQKAVSEGYKDFRAIAIASDMQDDFISPCGACRQVMREFGT-NWP    114

CDD_BACSU        103 VVLTNLQGQIKEMTVEELLPGAFSSEDL    130
                     |.:|...|....|||:||||.:|..|||
CDD_HUMAN        115 VYMTKPDGTYIVMTVQELLPSSFGPEDL    142

Таблица сравнения полученных выравниваний

Мерой совпадения двух выравниваний служит процент согласованных колонок первого (аналогично, второго) выравнивания относительно общего числа колонок.

Рассчитаем меру совпадения локального выравнивания, полученного программой BLAST, и оптимального глобального выравнивания последовательностей тех же белков. При этом ограничимся выравниванием фрагментов, входящих в оба выравнивания (в запросе: 4 - 131; в находке: 16 - 143).
Число согласовынных колонок для выбранных фрагментов - 129. Общее число колонок первого выравнивания - 129, второго выравнивания (для указанного фрагмента) - 129. Мера согласованности равна 100% для первого выравнивания и 100% для второго выравнивания.
Таким образом, все сопоставления в двух выравниваниях одинаковы.
Выбранный фрагмент оптимального глобального выравнивания составляет 86,6% от общей длины этого глобального выравнивания.

Аналогично рассчитаем меру совпадения локального выравнивания, полученного программой BLAST, и оптимального локального выравнивания последовательностей тех же белков. При этом ограничимся выравниванием фрагментов, входящих в оба выравнивания (в запросе: 4 - 130; в находке: 16 - 142).
Число согласовынных колонок - 128. Общее число колонок первого выравнивания (для выбранного фрагмента) - 128, второго выравнивания - 128. Мера согласованности равна 100% для первого выравнивания и 100% для второго выравнивания.
Таким образом, все сопоставления в двух выравниваниях одинаковы.
Выбранный фрагмент локального выравнивания, полученного программой BLAST, составляет 99,2% от общей длины этого локального выравнивания.

Дополнение страницы описаний программ

Раздел пакет EMBOSS страницы с описаниями программ дополнен описаниями следующих программ:

Поиск с альтернативными параметрами BLAST

При поиске, например, в базе данных nr изменим некоторые параметры (лимит количества находок, максимальное значение E-value, а также штрафы за гэпы). В результате получим 2487 находок с наибольшим значением E-value 49. Таким образом, в данном случае число находок будет лимитировано значением E-value. Первая находка по-прежнему будет совпадать с искомым белком.

Рассуждения о гомологии находки с E-value > 1

E-value - это ожидаемое количество случайных находок с таким же и лучшим весом в той же базе данных и при тех же параметрах. E-value = 1 означает, что в базе данных определённого размера возможна 1 совершенно случайная находка с таким же (или лучшим) весом. Соответственно, значение E-value больше 1 означает увеличение числа таких случаных находок.
При поиске изучаемого белка в базе данных Swiss-Prot (при параметрах поиска по умолчанию) мы обнаруживаем одну находку с E-value = 1.8, две находки с E-value = 3.4 и т.д.
Таким образом, данные находки попадают под критерий "случайности", следующий из определения E-value, и гомологами исходного белка, на мой взгляд, являться не будут.

Альтернативные интерфейсы к программе BLAST

Интерфейс к программе BLAST на сайте EBI:

Особенности интерфейса, которые обращают на себя внимание.

• Возможность одновременного выбора нескольких банков данных для поиска. Более удобный и структурированный список банков данных, который "испорчен" небольшим окошком списка доступных для поиска банков.
• Более удобный инструмент поиска с разделением на шаги ввода данных. Более "дружелюбное" представление дополнительных параметров.
• Возможность оповещения по электронной почте о доступности результатов запроса.
• Доступность результатов поиска в течение 7 дней по ссылке.
• Как правило, более долгий процесс поиска.
• Удобное представление результатов, с указанием областей поиска, нумерацией результатов, с начилием возможности управления находками, например, для загрузки всех результатов поиска или их части в виде файла.
• Отсутствие наглядного представления "покрытия" последовательностей при построении выравниваний для результатов поиска.
• "Спрятанные" выравнивания, которые при необходимости можно отобразить только для нужных находок или для всех сразу.
• "Нежелание" сервиса находить какие-либо результаты по указанному AC (при этом поиск по непосредственно введённой последовательности работает).
• Визуально более приятный и более удобный для чтения раздел помощи (Help).

Интерфейс к программе BLAST на сайте Expasy:

Особенности интерфейса, которые обращают на себя внимание.

• Неразумное распределение свободного места на экране, что, впрочем, не мешает использованию инструментов поиска.
• Пояснения к отдельным пунктам формы поиска вынесены на отделбную страницу, что неудобно.
• Возможность выбора представления результатов поиска уже на стадии заполнения формы поиска.
• Возможность оповещения по электронной почте о доступности результатов запроса.
• Субъективно более долгий процесс поиска.
• Возможность отправления выбранных последовательностей по электронной почте (с дополнительными опциями).
• Возможность представления результатов с группировкой по таксономическим признакам.
• Небольшой (но вполне достаточный) раздел помощи (Help) с неработающими ссылками на разделы помощи по BLAST на сайте NCBI.

Ссылки

1. Файл cdd_bacsu-cdd_human.needle - выравнивание, полученное программой needle.
2. Файл cdd_bacsu-cdd_human.water - выравнивание, полученное программой water.